Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas
Summary
As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.
Abstract
As interações entre receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e β-prendedor são processos vitais com implicações fisiológicas de grande importância. Atualmente, a caracterização de drogas novas para suas interações com β-prendedor e outras proteínas citosólico é extremamente valiosa no campo da descoberta da droga de GPCR particular durante o estudo do agonism tendencioso de GPCR. Aqui, mostramos a aplicação de um novo ensaio de complementação estrutural para monitorar com precisão as interações receptor-β-prendedor em sistemas vivos em tempo real. Este método é simples, exato e pode facilmente ser estendido a todo o GPCR do interesse e igualmente tem a vantagem que supera interações inespecíficas devido à presença de um promotor da baixa expressão atual em cada sistema do vetor. Este ensaio de complementação estrutural fornece características-chave que permitem um monitoramento preciso e preciso das interações receptor-β-prendedor, tornando-o adequado no estudo do agonismo tendencioso de qualquer sistema GPCR, bem como a fosforilação do GPCR c-Terminus códigos ‘ escritos por diferentes GPCR-quinases (GRKs) e modificações pós-translacionais de presas que estabilizam ou destabilizam o complexo receptor-β-prendedor.
Introduction
Os GPCRs representam o alvo de quase 35% dos fármacos atuais no mercado1,2 e um entendimento claro de sua farmacologia é crucial no desenvolvimento de novas drogas terapêuticas3. Um dos aspectos-chave na descoberta da droga de GPCR, particular durante o desenvolvimento de agonistas tendenciosos é a caracterização de ligantes novos para interações do receptor-β-prendedor4 e interações do β-prendedor com outras proteínas citosólico tais como clathrin5.
Foi documentado que a sinalização dependente do β-prendedor joga um papel chave em desordens neurológicas tais como a desordem bipolar, a depressão principal, e a esquizofrenia6 e igualmente efeitos secundários severos em alguns medicamentações tais como a morfina7.
Os métodos atuais usados para monitorar essas interações geralmente não representam os níveis endógenos reais das proteínas em estudo, em alguns casos eles mostram sinal fraco, fotobranqueamento e dependendo da GPCR pode ser tecnicamente desafiador para configurar8. Este novo ensaio de complementação estrutural utiliza vetores de promotor de baixa expressão para imitar os níveis fisiológicos endógenos e proporciona alta sensibilidade em relação aos métodos atuais9. Usando essa abordagem, foi possível caracterizar facilmente a galanin receptor-β-arrestin1/2 e também as interações β-arrestin2-clathrin10. Esta metodologia pode ser amplamente utilizada para qualquer GPCR de particular interesse onde os β-prendedor desempenham uma função fisiológica chave ou sua sinalização é relevante em algumas doenças.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando o método apresentado aqui, as interações entre todo o GPCR e β-arrestin1/2 podem ser monitoradas em sistemas vivos do tempo real usando este ensaio estrutural da complementação do GPCR-β-prendedor. Neste sentido, nós pudemos observar o recrutamento diferencial do β-prendedor entre as duas isoformas do β-prendedor pelo GLP-1R (uma classe protótipo B GPCR), nós igualmente observamos uma dissociação do complexo do receptor-β-prendedor alguns minutos após ter alcançado o máximo sinal luminescente.</p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa (NRF-2015M3A9E7029172) da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC, e planejamento futuro.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
