Overvåking GPCR-β-arrestin1/2 interaksjoner i Real time levende systemer for å akselerere Drug Discovery
Summary
GPCR-β-arrestin interaksjoner er et voksende felt i GPCR narkotika funnet. Nøyaktige, presise og enkle å sette opp metoder er nødvendig for å overvåke slike interaksjoner i levende systemer. Vi viser en strukturell komplementering analysen for å overvåke GPCR-β-arrestin interaksjoner i sanntid levende celler, og det kan utvides til enhver GPCR.
Abstract
Interaksjoner mellom G-protein kombinert reseptorer (GPCRs) og β-arrestins er vitale prosesser med fysiologiske implikasjoner av stor betydning. Foreløpig karakterisering av romanen medikamenter mot deres interaksjon med β-arrestins og andre cytosolic proteiner er svært verdifull innen GPCR narkotika funnet spesielt under studiet av GPCR partisk agonism. Her viser vi anvendelsen av en roman strukturelle komplementering analysen for å nøyaktig overvåke reseptor-β-arrestin interaksjoner i sanntid levende systemer. Denne metoden er enkel, nøyaktig og kan lett utvides til noen GPCR av interesse og også den har den fordelen at det overvinner løs interaksjoner på grunn av tilstedeværelsen av et lavt uttrykk arrangøren stede i hver vektor system. Denne strukturelle komplementering analysen gir viktige funksjoner som tillater en nøyaktig og presis overvåking av reseptor-β-arrestin interaksjoner, noe som gjør det egnet i studiet av partisk agonism av ethvert GPCR system samt GPCR c-Terminus ‘ fosforylering koder ‘ skrevet av forskjellige GPCR-kinaser (GRKs) og post-translational modifikasjoner av arrestins som stabiliserer eller destabilisere reseptoren-β-arrestin kompleks.
Introduction
GPCRs representerer målet på nesten 35% av dagens narkotika i markedet1,2 og en klar forståelse av deres farmakologi er avgjørende i utviklingen av romanen terapeutiske legemidler3. En av de viktigste aspektene i GPCR narkotika funnet, spesielt under utviklingen av partisk agonister er karakterisering av romanen ligander mot reseptor-β-arrestin interaksjoner4 og β-arrestin interaksjoner med andre cytosolic proteiner slik som clathrin5.
Det har blitt dokumentert at β-arrestin avhengige signalering spiller en nøkkelrolle i nevrologiske lidelser som bipolar lidelse, store depresjonen, og schizofreni6 og også alvorlige bivirkninger i noen medisiner som morfin7.
Gjeldende metoder som brukes til å overvåke disse interaksjoner vanligvis ikke representerer faktiske endogene nivåer av proteiner i studien, i noen tilfeller viser de svake signal, photobleaching og avhengig av GPCR det kan være teknisk utfordrende å sette opp8. Denne romanen strukturelle komplementering analysen bruker lavt uttrykk promoter vektorer for å etterligne endogene fysiologiske nivåer og gir høy følsomhet i forhold til dagens metoder9. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var det mulig å enkelt karakterisere Galanin reseptor-β-arrestin1/2 og også β-arrestin2-clathrin interaksjoner10. Denne metodikken kan bli mye brukt til noen GPCR av spesiell interesse der β-arrestins spille en viktig fysiologisk funksjon eller deres signalering er relevant i enkelte sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av metoden som presenteres her, interaksjoner mellom noen GPCR og β-arrestin1/2 kan overvåkes i sanntid levende systemer ved hjelp av denne GPCR-β-arrestin strukturelle komplementering analysen. I denne forbindelse var vi i stand til å observere differensial β-arrestin rekruttering mellom de to β-arrestin isoformene av GLP-1R (A prototypiske klasse B GPCR), vi observerte også en dissosiasjon av reseptoren-β-arrestin kompleks noen få minutter etter å ha nådd det maksimale selvlysende signal.
<p cl…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av stipend fra forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
