약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링
Summary
GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.
Abstract
G 단백질 결합 된 수용 체 사이 상호 작용 (GPCRs) 그리고 β-arrestins는 매우 중요 한 생리적 의미와 중요 한 과정. 현재, β-arrestins 및 그밖 cytosolic 단백질과의 상호 작용을 향해 새로운 약의 특성은 GPCR 편향된 agonism의 연구 도중 특히 GPCR 약 발견의 필드에서 극단적으로 귀중합니다. 여기서, 우리는 실시간 살아있는 시스템에서 수용체-β-레체아핀 상호작용을 정확하게 모니터링하기 위한 새로운 구조적 보완 분석법의 적용을 보여준다. 이 방법은 간단하고 정확하며 관심 있는 임의의 GPCR까지 용이하게 확장될 수 있으며 또한 각 벡터 시스템에 존재하는 낮은 발현 프로모터의 존재로 인해 비특이적 상호작용을 극복할 수 있다는 장점이 있다. 이 구조적 보완 분석법은 수용체-β-arrestin 상호 작용의 정확하고 정확한 모니터링을 허용하는 주요 기능을 제공하여 GPCR 시스템의 편향된 작용뿐만 아니라 GPCR c-종단 ‘인산화의 연구에 적합합니다. 다른 GPCR 키나아제 (GRKs)와 수용체 β-arrestin 복합체를 안정화하거나 불안정하게 하는 체포의 번역 후 수정에 의해 작성된 코드.
Introduction
GPCR은 현재 시중에서 약품의 약35%를 대상으로 하고 있으며, 이들의 약리학에 대한 명확한 이해는 새로운 치료제 의 개발에 매우 중요하다 3. GPCR 약 발견에 있는 중요한 양상의 한개는, 특히 편향된 작용제의 발달 도중 수용체 β-arrestin 상호 작용4 및 β-arrestin 상호 작용과 같은 그밖 cytosolic 단백질을 향한 새로운 리간드의 특성입니다 클래트린5.
β-arrestin 의존성 신호는 양극성 장애, 주요 우울증 및 정신 분열증 6과 같은 신경 장애에 중요한 역할을 하며 모르핀7과 같은 일부 약물에서도 심각한 부작용을 가지고 있다는 것이 문서화되었다.
이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 사용되는 현재의 방법은 일반적으로 연구에서 단백질의 실제 내인성 수준을 나타내지 않으며, 어떤 경우에는 약한 신호, 광표백및 GPCR에 따라 8을 설정하는 것이 기술적으로 어려울 수 있습니다. 이러한 새로운 구조적 보완 분석법은 내인성 생리학적 수준을 모방하기 위해 낮은 발현 프로모터벡터를 사용하고 현재 방법 9에 비해 높은 감도를 제공한다. 이러한 접근법을 사용하여, 갈라닌 수용체-β-arrestin1/2 및 또한 β-arrestin2-클라트린 상호작용10을쉽게 특성화할 수 있었다. 이 방법론은 β-arrestins가 중요한 생리기능을 재생하거나 그들의 신호가 몇몇 질병에서 관련있는 특정 관심사의 어떤 GPCR든지에 널리 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 방법을 사용하여, 임의의 GPCR 및 β-arrestin1/2 사이의 상호작용은 이 GPCR-β-arrestin 구조적 보완 분석법을 사용하여 실시간 생활 시스템에서 모니터링될 수 있다. 이와 관련하여, 우리는 GLP-1r (프로토 타입 클래스 B GPCR)에 의해 두 개의 β-arrestin 이소폼 사이의 차동 β-arrestin 모집을 관찰 할 수 있었고, 우리는 또한 수용체 β-arrestin 복합체의 해리를 최대에 도달한 후 몇 분 후에 관찰했습?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 과학기술정보통신부가 후원하는 국립연구재단(NRF)의 연구프로그램(NRF-2015M3A9E7029172)의 보조금으로 지원되었다.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
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