निगरानी GPCR-जेड-arrestin1/2 ड्रग डिस्कवरी में तेजी लाने के लिए वास्तविक समय रहने वाले सिस्टम में बातचीत
Summary
GPCR-जेड-arrestin बातचीत GPCR दवा की खोज में एक उभरते क्षेत्र हैं. सटीक, सटीक और आसान तरीके स्थापित करने के लिए जीवन प्रणाली में इस तरह के बातचीत की निगरानी के लिए आवश्यक हैं. हम वास्तविक समय जीवित कोशिकाओं में GPCR-जेड-arrestin बातचीत की निगरानी करने के लिए एक संरचनात्मक पूरक परख दिखाने के लिए, और यह किसी भी GPCR करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) और जेड-arrestins के बीच बातचीत महान महत्व के शारीरिक प्रभाव के साथ महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं रहे हैं. वर्तमान में, विशेष रूप से GPCR पक्षपाती agonism के अध्ययन के दौरान GPCR दवा की खोज के क्षेत्र में उनके साथ बातचीत की दिशा में उपन्यास दवाओं की विशेषता – arrestins और अन्य साइटोसोलिक प्रोटीन अत्यंत मूल्यवान है. यहाँ, हम एक उपन्यास संरचनात्मक पूरक परख के आवेदन को सही ढंग से वास्तविक समय में रहने वाले सिस्टम में रिसेप्टर-जेड-arrestin बातचीत की निगरानी के लिए दिखा. इस विधि सरल, सटीक है और आसानी से ब्याज की किसी भी GPCR करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और यह भी लाभ है कि यह एक कम अभिव्यक्ति प्रत्येक वेक्टर प्रणाली में मौजूद प्रमोटर की उपस्थिति के कारण विशिष्ट बातचीत पर काबू पा लिया है. यह संरचनात्मक पूरक परख प्रमुख विशेषताएं प्रदान करता है जो रिसेप्टर-जेड-arrestin बातचीत की सटीक और सटीक निगरानी की अनुमति देते हैं, जिससे यह किसी भी जीपीसीआर प्रणाली के पक्षपाती एगोनिज्म के अध्ययन के साथ-साथ जीपीसीआर सी-टर्मिनस ‘फॉस्फोरिलेशन’ की अनुमति देता है। विभिन्न जीपीसीआर-किनेस (GRKs) और arrestins के बाद अनुवाद संशोधनों द्वारा लिखा गया है जो रिसेप्टर-जेड-arrestin परिसर को स्थिर या अस्थिर करते हैं।
Introduction
जीपीसीआर बाजार में वर्तमान औषधों के लगभग35% के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करती है,2 और उनकी औषध विज्ञान की स्पष्ट समझ उपन्यास चिकित्सीय औषधों3के विकास में महत्वपूर्ण है . GPCR दवा की खोज में प्रमुख पहलुओं में से एक, विशेष रूप से पक्षपाती agonists के विकास के दौरान रिसेप्टर की ओर उपन्यास ligands की विशेषता है– arrestin बातचीत4 और अन्य cytosolic प्रोटीन के साथ – arrestin बातचीत इस तरह के रूप में clathrin5|
यह प्रलेखित किया गया है कि द्विध्रुवी विकार, प्रमुख अवसाद, और स्किज़ोफ्रेनिया6 जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों में जेड-arrestin निर्भर संकेतन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कुछ दवाओं जैसे मॉर्फिन7में गंभीर साइड इफेक्ट्स भी हैं।
इन बातचीत पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया वर्तमान तरीकों आमतौर पर अध्ययन में प्रोटीन की वास्तविक अंतर्जात स्तर का प्रतिनिधित्व नहीं करते, कुछ मामलों में वे कमजोर संकेत दिखाने के लिए, photobleaching और GPCR के आधार पर यह तकनीकी रूप से स्थापित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकताहै 8. यह उपन्यास संरचनात्मक पूरक परख अंतर्जात शारीरिक स्तरों की नकल करने के लिए कम अभिव्यक्ति प्रवर्तक सदिशों का उपयोग करता है और वर्तमान विधियों9की तुलना में उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है . इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, यह आसानी से Galanin रिसेप्टर की विशेषता के लिए संभव था-जेड-arrestin1]2 और यह भी [-arrestin2-clathrin बातचीत10. इस पद्धति को व्यापक रूप से विशेष हित के किसी भी GPCR के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां – arrestins एक प्रमुख शारीरिक समारोह खेलते हैं या उनके संकेत कुछ रोगों में प्रासंगिक है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि का उपयोग करना, किसी भी GPCR और जेड-arrestin1]2 के बीच बातचीत वास्तविक समय में रहने वाले सिस्टम में नजर रखी जा सकती है इस GPCR-जेड-arrestin संरचनात्मक पूरक परख का उपयोग कर. इस संबंध में, हम GLP-1r (एक protypical कक्षा ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी, और भविष्य की योजना द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के अनुसंधान कार्यक्रम (एनआरएफ 2015M3A9E7172) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
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