Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments
Summary
Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n’importe quel GPCR.
Abstract
Les interactions entre les récepteurs couplés à la protéine G (GpCR) et les arrestins sont des processus vitaux ayant des implications physiologiques de grande importance. À l’heure actuelle, la caractérisation de nouveaux médicaments en vue de leurs interactions avec les arrestins et autres protéines cytosoliques est extrêmement précieuse dans le domaine de la découverte de médicaments par GPCR, en particulier lors de l’étude de l’agonisme biaisé du GPCR. Ici, nous montrons l’application d’un nouveau test de complémentarité structurelle pour surveiller avec précision les interactions récepteur-arrestin dans les systèmes vivants en temps réel. Cette méthode est simple, précise et peut être facilement étendue à n’importe quel GPCR d’intérêt et a également l’avantage qu’elle surmonte les interactions non spécifiques en raison de la présence d’un promoteur de faible expression présent dans chaque système vectoriel. Cet analyse de complémentarité structurelle fournit des caractéristiques clés qui permettent une surveillance précise et précise des interactions récepteur-arrestin, ce qui le rend approprié dans l’étude de l’agonisme biaisé de tout système GPCR ainsi que GPCR c-terminus ‘phosphorylation codes écrits par différents GPCR-kinases (GRKs) et des modifications post-traductionnelle des arrestins qui stabilisent ou déstabilisent le complexe récepteur—arrestin.
Introduction
Les GPCR représentent la cible de près de 35 % des médicaments actuels sur le marché1,2 et une compréhension claire de leur pharmacologie est cruciale dans le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques3. L’un des aspects clés de la découverte de médicaments par le GPCR, en particulier pendant le développement d’agonistes biaisés, est la caractérisation de nouveaux ligands vers les interactions récepteur-arrestin4 et les interactions de l’arrestine avec d’autres protéines cytosoliques telles que comme clathrine5.
Il a été documenté que la signalisation dépendante de l’arrêt-arrêt joue un rôle clé dans les troubles neurologiques tels que le trouble bipolaire, la dépression majeure, et la schizophrénie6 et aussi des effets secondaires graves dans certains médicaments tels que la morphine7.
Les méthodes actuelles utilisées pour surveiller ces interactions ne représentent généralement pas les niveaux endogènes réels des protéines à l’étude, dans certains cas, ils montrent un signal faible, photoblanchiment et en fonction de la GPCR, il pourrait être techniquement difficile de mettre en place8. Ce nouvel exemple de complémentarité structurelle utilise des vecteurs de promoteur à faible expression afin d’imiter les niveaux physiologiques endogènes et fournit une sensibilité élevée par rapport aux méthodes actuelles9. En utilisant cette approche, il a été possible de caractériser facilement le récepteur Galanin–arrestin1/2 et aussi les interactions de la clathrine10. Cette méthodologie peut être largement utilisée à n’importe quel GPCR d’intérêt particulier où les ‘-arrestins jouent une fonction physiologique clé ou leur signalisation est pertinente dans certaines maladies.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant la méthode présentée ici, les interactions entre n’importe quel GPCR et ‘-arrestin1’2 peuvent être surveillées dans des systèmes de vie en temps réel en utilisant cet analyse de complémentation structurale GPCR—arrestin. À cet égard, nous avons pu observer un recrutement différentiel entre les deux isoformes de l’arrêt-arrêt par le GLP-1r (UN GPCR prototypique de classe B), nous avons également observé une dissociation du complexe récepteur–arrestin quelques minutes après avoir atteint le…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions du Programme de recherche (NRF- 2015M3A9E7029172) de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le Ministère des sciences, des TIC et de la Planification future.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
Referencias
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