Modulazione della localizzazione subcellulare Tau come strumento per studiare l'espressione dei geni correlati alla malattia
Summary
Il Tau è una proteina neuronale presente sia nel citoplasma, dove lega i microtubuli, sia nel nucleo, dove esercita funzioni non convenzionali tra cui la modulazione dei geni correlati alla malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo un metodo per studiare la funzione del Tau nucleare escludendo eventuali interferenze provenienti da citoplasmatica Tau.
Abstract
Il Tau è una proteina legante di microtubuli espressa nei neuroni e la sua principale funzione nota è legata al mantenimento della stabilità citoscheletrica. Tuttavia, prove recenti hanno indicato che Tau è presente anche in altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo in cui è implicato nella protezione del DNA, nella trascrizione del rRNA, nella mobilità dei retrotrasposoni e nell’organizzazione strutturale del nucleolus. Recentemente abbiamo dimostrato che il Tau nucleare è coinvolto nell’espressione del gene VGluT1, suggerendo un meccanismo molecolare che potrebbe spiegare l’aumento patologico del rilascio del glutammato nelle prime fasi del morbo di Alzheimer. Fino a poco tempo fa, il coinvolgimento del Tau nucleare nella modulazione dell’espressione dei geni bersaglio è stato relativamente incerto e ambiguo a causa di limitazioni tecniche che impedivano l’esclusione del contributo di Tau citoplasmico o dell’effetto di altri fattori a valle non correlati al Tau nucleare. Per superare questa incertezza, abbiamo sviluppato un metodo per studiare l’espressione di geni bersaglio specificamente modulati dalla proteina Nucleare Tau. Abbiamo impiegato un protocollo che afcoppia l’uso di segnali di localizzazione e la frazione subcellulare, consentendo l’esclusione dell’interferenza dalle molecole citoplasmiche Tau. In particolare, il protocollo è facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule e condizioni cellulari.
Introduction
Le funzioni della proteina Tau nel nucleo hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, in quanto è stato dimostrato essere strettamente associato agli acidi nucleici1,2,3,4,5,6. Ineffetti, un recente studio a livello di genoma ha dimostrato che Tau lega sequenze di DNA genico e intergenico in vivo7. Un ruolo nell’organizzazione nucleolare è stato suggerito8,9,10,11. Inoltre, è stato proposto che Tau sia coinvolto nella protezione del DNA dallo stress ossidativo e ipertermico5,10,12,13, mentre Tau mutato è stato collegato all’instabilità cromosomica e all’aneuploidità14,15,16.
Fino ad ora, le sfide nello studio delle funzioni di Tau nel compartimento nucleare sono rimaste quasi irrisolte a causa delle difficoltà nel sezionare il contributo specifico del Tau nucleare dal contributo di Citoplasma Tau. Inoltre, le funzioni attribuite alle molecole Tau nel compartimento nucleare, fino ad ora, sono correlate solo perché mancano di una dimostrazione inequivocabile del coinvolgimento diretto delle proteine Nucleari Tau. Infatti, il coinvolgimento di Tau nella mobilità dei retrotrasposoni o nella trascrizione del rRNA o nella protezione del DNA11,12,17,18,19 potrebbe essere spiegato anche dal contributo di Tau citoplasmico o dall’effetto di altri fattori a valle non legati al Tau nucleare.
Qui, forniamo un metodo che può risolvere questo problema sfruttando una procedura classica per isolare il compartimento nucleare combinato con l’uso di costrutti Tau 0N4R etichettati con localizzazione nucleare (NLS) o segnali di esportazione nucleare (NES). Questo approccio elimina i complessi problemi relativi ai possibili artefatti dovuti alla fuoriuscita di molecole Tau dal compartimento citoplasmatico. Inoltre, i costrutti Tau-NLS e Tau-NES inducono l’arricchimento o l’esclusione delle molecole Tau dal compartimento nucleare, rispettivamente, fornendo controlli positivi e negativi per il coinvolgimento delle molecole nucleari Tau in una funzione specifica. Il protocollo è tecnicamente facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule, differenziate o meno, come le cellule tumorali che riattivano l’espressione Tau20,21. Inoltre, potrebbe essere applicato anche ad altre proteine che sono presenti sia nel citoplasma che nel nucleo al fine di sezionare le funzioni biologiche relative a diversi compartimenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un metodo per misurare l’impatto della proteina Tau nucleare sull’espressione genica. Con questo protocollo il contributo di Tau citoplasmatica è fortemente limitato. I passaggi critici di questo protocollo sono i seguenti: la differenziazione delle cellule umane del neuroblastoma SH-SY5Y, la frazione subcellulare e la localizzazione della proteina Tau nel compartimento nucleare.
In primo luogo, come mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi, la differenziazione delle c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni di Normale Scuola Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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