Modulation der subzellulären Lokalisierung von Tau als Werkzeug zur Untersuchung der Expression krankheitsbedingter Gene
Summary
Tau ist ein neuronales Protein, das sowohl im Zytoplasma, wo es Mikrotubuli bindet, als auch im Kern, wo es unkonventionelle Funktionen wie die Modulation von Alzheimer-Gene ausübt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Funktion von nuklearem Tau unter Ausschluss von Interferenzen, die von zytoplasmatischem Tau kommen.
Abstract
Tau ist ein Mikrotubuli-bindendes Protein, das in Neuronen exprimiert wird und seine wichtigste bekannte Funktion mit der Aufrechterhaltung der Zytoskelettstabilität zusammenhängt. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass Tau auch in anderen subzellulären Kompartimenten vorhanden ist, einschließlich des Kerns, in dem er in den DNA-Schutz, in die rRNA-Transkription, in die Mobilität von Retrotransposons und in die strukturelle Organisation der Nukleolus. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass nukleare Tau an der Expression des VGluT1-Gens beteiligt ist, was auf einen molekularen Mechanismus hindeutet, der die pathologische Zunahme der Glutamatfreisetzung in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit erklären könnte. Bis vor kurzem war die Beteiligung von Nuclear Tau an der Modulation der Expression von Zielgenen aufgrund technischer Einschränkungen, die den Ausschluss des Beitrags von zytoplasmatischem Tau oder die Wirkung anderer nachgeschaltete Faktoren, die nicht mit dem nuklearen Tau zusammenhängen. Um diese Ungewissheit zu überwinden, entwickelten wir eine Methode, um die Expression von Zielgenen zu untersuchen, die speziell durch das nukleare Tau-Protein moduliert werden. Wir verwendeten ein Protokoll, das die Verwendung von Lokalisationssignalen und der subzellulären Fraktionierung koppelt, was den Ausschluss der Interferenz von den zytoplasmatischen Tau-Molekülen ermöglicht. Vor allem ist das Protokoll einfach und besteht aus klassischen und zuverlässigen Methoden, die allgemein anwendbar sind, um die kernnukleare Funktion von Tau in anderen Zelltypen und zellulären Bedingungen zu untersuchen.
Introduction
Die Funktionen des Tau-Proteins im Zellkern haben in den letzten Jahren großes Interesse geweckt, da es nachweislich eng mit Nukleinsäuren1,2,3,4,5,6verbunden ist. Tatsächlich hat eine kürzlich durchgeführte genomweite Studie gezeigt, dass Tau in vivo7genic- und intergene DNA-Sequenzen bindet. Eine Rolle in der nukleolaren Organisation wurde vorgeschlagen8,9,10,11. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, Tau in den DNA-Schutz vor oxidativem und hyperthermischem Stress5,10,12,13, zu beteiligen, während mutierte Tau mit Chromosomeninstabilität und Aneuploidie14,15,16verbunden wurde.
Bisher blieben die Herausforderungen bei der Untersuchung der Funktionen von Tau im Nuklearbereich aufgrund der Schwierigkeiten, den spezifischen Beitrag der nuklearen Tau aus dem Beitrag der zytoplasmatischen Tau zu sezieren, nahezu ungelöst. Darüber hinaus sind die Funktionen, die Tau-Molekülen im Kernraum zugeschrieben werden, bisher nur korrelativ, weil sie keine eindeutige Demonstration der direkten Beteiligung nuklearer Tau-Proteine haben. Die Beteiligung von Tau an der Mobilität von Retrotransposons oder an der rRNA-Transkription oder am DNA-Schutz11,12,17,18,19 könnte auch durch den Beitrag von zytoplasmatischem Tau oder durch die Wirkung anderer nachgelagerter Faktoren, die nicht mit nuklearem Tau zusammenhängen, erklärt werden.
Hier bieten wir eine Methode, die dieses Problem lösen kann, indem wir ein klassisches Verfahren nutzen, um das Kernfach in Kombination mit der Verwendung von Tau-Konstrukten 0N4R mit der T-Flagge für nukleare Lokalisierung (NLS) oder nukleare Exportsignale (NES) zu isolieren. Dieser Ansatz beseitigt die komplexen Probleme im Zusammenhang mit möglichen Artefakten aufgrund des Spillovers von Tau-Molekülen aus dem zytoplasmatischen Fach. Darüber hinaus induzieren Tau-NLS- und Tau-NES-Konstrukte die Anreicherung bzw. den Ausschluss von Tau-Molekülen aus dem Kernraum und bieten positive und negative Kontrollen für die Beteiligung nuklearer Tau-Moleküle an einer bestimmten Funktion. Das Protokoll ist technisch einfach und besteht aus klassischen und zuverlässigen Methoden, die allgemein anwendbar sind, um die kernnukleare Funktion von Tau in anderen Zelltypen zu untersuchen, differenziert oder nicht, wie Krebszellen, die den Tau-Ausdruck20,21reaktivieren. Darüber hinaus könnte es auch auf andere Proteine angewendet werden, die sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern vorhanden sind, um biologische Funktionen im Zusammenhang mit verschiedenen Kompartimenten zu sezieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine Methode, um die Auswirkungen des nuklearen Tau-Proteins auf die Genexpression zu messen. Mit diesem Protokoll ist der Beitrag der zytoplasmatischen Tau stark begrenzt. Kritische Schritte dieses Protokolls sind die folgenden: die Differenzierung der menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen, die subzelluläre Fraktionierung und die Lokalisierung von Tau-Protein im Kernraum.
Erstens, wie im repräsentativen Ergebnisabschnitt gezeigt, ist die Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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