Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Le cellule utilizzano il processo attivo di traffico per mobilitare le proteine a specifiche localizzazioni subcellulari ed esercitare una rigorosa regolazione spatiotemporale sulla loro funzione¹. Questo processo è particolarmente importante per i recettori transmembrani, poiché le risposte cellulari a diversi stimoli ambientali si basano su cascate intracellulari innescate dall’attivazione del recettore. Le cellule sono in grado di modificare queste risposte alterando la densità, la localizzazione e la composizione delle sottounità dei recettori espressi sulla superficie cellulare tramite il regolamento del traffico subcellulare del recettore^{2 .} L’inserimento di nuovi recettori sintetizzati nella membrana plasmatica, insieme all’endocitosi e al riciclaggio dei recettori esistenti sono esempi di processi di traffico che determinano il pool netto di recettori espressi in superficie². Molti meccanismi molecolari cooperano per regolare il traffico di proteine, comprese le interazioni proteina-proteina e le modifiche post-traduzionali come il fosforo, l’ubiquitinazione o il palmitoylation².

La regolazione del traffico dei recettori è particolarmente necessaria in cellule fortemente polarizzate con strutture altamente specializzate. L’esempio paradigmatico è il controllo della funzione neuronale mediante traffico regolato di recettori del glutammato (GluR)^3,4. Glutamate, il principale neurotrasmettitore eccitatorio, lega e attiva GluR espressi in superficie per controllare le funzioni neuronali fisiologiche fondamentali come la neurotrasmissione sinaptica e la plasticità sinaptica. Il fatto che il traffico alterato di GluR sia stato osservato in un ampio spettro di neuropatie, che vanno dai disturbi del neurosviluppo alle malattie neurodegenerative, evidenzia l’importanza di questo processo⁵. Pertanto, comprendere gli eventi molecolari che controllano il traffico di GluR è di interesse in molte aree di ricerca.

In questo protocollo, viene utilizzato un metodo basato sull’alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di GluR espressi in superficie nei neuroni ippocampali primari, nonché per valutare come i cambiamenti nell’internalizzazione e nel riciclo si traducano nell’espressione della superficie netta osservata. L’uso di farmacologia e/o sovraespressione di recettori esogeni che ospitano mutazioni specifiche rende questo protocollo un approccio particolarmente potente per studiare i meccanismi molecolari alla base dell’adattamento neuronale a diversi stimoli ambientali. Un ultimo esempio dell’utilità di questo protocollo è lo studio di come i cambiamenti multifattoriali nell’ambiente (come in un modello di malattia) influenzino il traffico di GluR attraverso l’esame dell’espressione superficiale in tali modelli.

Utilizzando esempi specifici, è inizialmente dimostrato come una manipolazione farmacologica che imita la stimolazione sinaptica fisiologica [LTP chimico (cLTP)] aumenti l’espressione superficiale della sottounità endogena GluA1 del tipo AMPA dei GluR (AMPAR) ^6.Il traffico di una forma fosforo-mimetica sovraespressa della sottounità GluN2B di NLUDA-tipo di GluRs (NMDAR) viene analizzato anche per esemplificare come questo protocollo può essere utilizzato per studiare la regolazione del traffico di GluR da parte di specifiche post-traslazionali Modifiche. Anche se questi esempi specifici sono utilizzati, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altri GluR e altri recettori e proteine che possiedono domini extracellulari antigenici. Nel caso in cui non siano disponibili anticorpi per i domini extracellulari, la sovraespressione delle proteine con etichettatura epitope extracellulare (ad esempio, Flag-, Myc-, GFP-tagged, ecc.) può aiutare nell’etichettatura delle proteine.

L’attuale protocollo fornisce istruzioni per quantificare la densità e il traffico specifici di sottotipi di GluR utilizzando anticorpi specifici. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare 1) espressione di superficie GluR totale, 2) internalizzazione GluR e 3) riciclaggio di GluR. Per studiare ogni processo singolarmente, si consiglia di iniziare con le sezioni 1 e 2 e continuare con le sezioni 3, 4 o 5. In tutti i casi, terminare con le sezioni 6 e 8 (Figura 1).