Parasponia andersonii is een snelgroeiende tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae) en kan stikstof fixerende wortel knobbeltjes vormen in samenwerking met de Rhizobium. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor omgekeerde genetische analyses in P. andersonii op basis van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde stabiele transformatie en op crispr/Cas9 gebaseerde genoom bewerking.
Parasponia andersonii is een snelgroeiende tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae). Samen met 4 extra soorten vormt het de enige bekende niet-peulvrucht Lineage die een stikstoffixatie van knobbel-symbiose met Rhizobium tot stand kan brengen. Vergelijkende studies tussen peulvruchten en P. andersonii kunnen waardevol inzicht geven in de genetische netwerken die de onderliggende knobbel-formatie vormen. Om vergelijkende studies te faciliteren, hebben we onlangs het P. andersonii genoom en de gevestigde Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde stabiele transformatie en crispr/Cas9 gebaseerde genoom Editing gesequenced. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van de transformatie-en genoom bewerkingsprocedures die zijn ontwikkeld voor P. andersonii. Daarnaast beschrijven we procedures voor de kiem ontkieming en karakterisering van symbiotische fenotypes. Met dit protocol kunnen stabiele transgene Mutant lijnen worden gegenereerd in een periode van 2-3 maanden. Vegetatieve in vitro vermeerdering van T0 transgene lijnen maakt het mogelijk fenotyping experimenten uit te voeren na 4 maanden na de co-teelt van A. tumefaciens . Daarom is dit protocol slechts marginaal langer dan de voorbijgaande Agrobacterium rhizogenesgebaseerde wortel transformatie methode die beschikbaar is voor P. andersonii, maar biedt een aantal duidelijke voordelen. Samen staan de hier beschreven procedures toe om P. andersonii te gebruiken als een onderzoeksmodel voor studies gericht op het begrijpen van symbiotische associaties en mogelijk andere aspecten van de biologie van deze tropische boom.
Parasponia andersonii is een tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae) en is inheems in Papoea-Nieuw-Guinea en verschillende Pacifische eilanden1,2,3. Samen met 4 extra parasponia -soorten vertegenwoordigt het de enige Lineage van niet-peulvruchten die een stikstoffixatie van knobbel-symbiose met Rhizobia kan instellen. Deze symbiose is goed bestudeerd in de peulvruchten (Fabaceae) modellen Medicago truncatula es Lotus japonicus, die heeft geresulteerd in het verwerven van gedetailleerde kennis van de moleculaire genetische aard van knobbel vorming en functioneren4. Bovendien werd aangetoond dat de wortel knokkel symbiose in peulvruchten wordt gebaseerd op de veel oudere en wijdverbreide arbusculaire behorend symbiose5. Fylogenomische vergelijkingen suggereren dat de stikstof-Fixing knobbel symbiose van peulvruchten, parasponia, evenals, de zogenaamde actinorhizal plantensoorten die gastheer diazotrofische frankia bacteriën, hebben een gedeelde evolutionaire oorsprong 6,7,8. Om te bepalen of de genen die zijn geïdentificeerd om te worden betrokken bij de vorming van peulvruchten zijn het deel van een gediende genetische basis, studies over niet-peulvruchten soorten zijn essentieel. Daarom stellen wij voor om P. andersonii te gebruiken als vergelijkend onderzoeksmodel, naast peulvruchten, om de belangrijkste genetische netwerken te identificeren die de onderliggende knobbel-vorming en-werking vormen.
P. andersonii is een pionier die kan worden gevonden op de hellingen van vulkanische heuvels. Het kan voldoen aan de groeisnelheden van 45 cm per maand en bereik lengtes tot 10 meter9. P. andersonii bomen zijn wind-bestuikte, die wordt vergemakkelijkt door de vorming van aparte mannelijke en vrouwelijke bloemen3,10. We hebben onlangs het diploïde genoom (2n = 20; 560 MB/1C) van P. andersoniigesequenced en geannoteerd en een concept genoomsequenties van 2 extra parasponia -soorten samengesteld; P. rigida es p. rugosa6. Dit onthulde ~ 35.000 P. andersonii Gene modellen die kunnen worden geclusterd in > 20000 orthogroepen samen met genen van m. truncatula, sojabonen (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Woodland aardbei ( Fragaria russula), trema orientalis, Black Cotton populier (Populus balsem) en eucalyptueuze (eucalyptus grandis)6. Bovendien identificeerden transcriptome vergelijkingen tussen M. truncatula es P. andersonii een set van 290 putatieve orthologues die een nodule-verbeterd expressie patroon in beide soorten6vertonen. Dit biedt een uitstekende bron voor vergelijkende studies.
Om de genfunctie in P. andersonii wortels en knobbeltjes te bestuderen, is een protocol voor Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde wortel transformatie vastgesteld11. Met dit protocol kunnen samengestelde planten die transgene wortels dragen in een relatief kort tijdsbestek worden opgewekt. Deze methode is, ook, op grote schaal toegepast in het onderzoek van de leguaan-symbiose12,13,14. Het nadeel van deze methode is echter dat alleen wortels worden getransformeerd en dat elke transgene wortel een onafhankelijk transformatie evenement vormt, wat resulteert in substantiële variatie. De transformatie is ook van voorbijgaande aard en transgene lijnen kunnen niet worden gehandhaafd. Dit maakt A. rhizogenesgebaseerde wortel transformatie minder geschikt voor crispr/Cas9-gemedieerde genoom bewerking. Bovendien, A. rhizogenes draagt zijn wortel inducerende Locus (rol) genen naar de plant genoom, die eenmaal uitgedrukt interfereren met hormoon homeostase15. Dit maakt het bestuderen van de rol van plantenhormonen in A. rhizogenes-getransformeerde wortels uitdagend. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we recentelijk een protocol ontwikkeld voor de transformatie van Agrobacterium tumefaciensen crispr/Cas9-gemedieerde mutagenese van P. andersonii10.
Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van de a. tumefaciens-gebaseerde transformatie procedure en reverse genetics pipeline ontwikkeld voor P. andersonii. Daarnaast bieden we protocollen voor de downstream behandeling van transgene plantlets, inclusief assays om symbiotische interacties te bestuderen. Met behulp van het protocol dat hier wordt beschreven, kunnen meerdere transgene lijnen worden gegenereerd in een periode van 2-3 maanden. In combinatie met CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese, maakt dit een efficiënte generatie van afdek gemuteerde lijnen mogelijk. Deze gemuteerde lijnen kunnen vegetatief worden gekweekt in vitro10,16,17, waardoor voldoende materiaal kan worden gegenereerd om fenotypische karakterisering te starten na 4 maanden nadat de transformatie procedure 10is geïnitieerd. Dit geheel van procedures moet een laboratorium in staat stellen om P. andersonii te adopteren als een onderzoeksmodel voor studies gericht op het begrijpen van de verenigingen van rhizobial en behorend, evenals mogelijk andere aspecten van de biologie van deze tropische boom.
Peulvruchten en het verre-gerelateerde Cannabaceae-geslacht Parasponia representeren de enige twee clades van plantensoorten die een endosymbiotische relatie met stikstoffixatie van Rhizobia kunnen vestigen en wortel knobbeltjes vormen. Vergelijkende studies tussen soorten van beide clades zijn zeer relevant om inzicht te geven in de belangrijkste genetische netwerken die deze symbiose mogelijk maken. Momenteel worden genetische studies voornamelijk gedaan in peulvruchten; vooral de twee model soorten M. truncatula es L. japonicus. Om een aanvullend experimenteel platform te bieden en vergelijkende studies te faciliteren met een nodulating non-legume, beschrijven we hier een gedetailleerd protocol voor stabiele transformatie en omgekeerde genetische analyses in P. andersonii. Het gepresenteerde protocol gebruikt in vitro vermeerdering van T0 transgene P. andersonii lijnen, waardoor fenotypische analyse kan worden gestart binnen 4 maanden na A. tumefaciens co-teelt. Dit is aanzienlijk sneller dan de huidige protocollen die zijn vastgesteld voor stabiele transformatie van peulvruchten33. Dit maakt P. andersonii een aantrekkelijk onderzoeksmodel.
Het hier beschreven protocol bevat verschillende kritieke stappen. Het eerste betreft zaadkieming. Om P. andersonii zaden voor kieming voor te bereiden, moeten zaden worden geïsoleerd van de bessen. Dit wordt gedaan door de bessen op een stukje tissuepapier te wrijven of tegen de binnenkant van een theezeef. Deze procedure moet voorzichtig worden uitgevoerd om beschadiging van de zaadmantel te voorkomen. Als de zaadmantel beschadigd raakt, kan bleekmiddel het zaad binnengaan tijdens sterilisatie, wat de levensvatbaarheid van het zaad vermindert. Om zaad Kiemrust te breken, zaden worden onderworpen aan een 10-daagse temperatuur cyclus. Ondanks deze behandeling wordt de kiemkracht echter niet volledig gesynchroniseerd. Over het algemeen tonen de eerste zaden uitstulping opkomst na 7 dagen, maar anderen kunnen enkele dagen langer duren om te ontkiemen.
Kritische punten in de transformatie procedure betreffen de keuze van het uitgangsmateriaal en de duur van de co-teelt stap. Om een efficiënte transformatie te bereiken, is het het beste om gezonde en jonge stengels of petiolen van niet-steriele kas-gekweekte planten als uitgangsmateriaal te gebruiken. Om de groei van jonge takken te stimuleren, is het raadzaam om de Parasponia bomen elke 2-3 maanden te trimmen en de bomen een keer per jaar te verversen. Bovendien moet de co-teelt stap alleen worden uitgevoerd voor 2 dagen. Langdurige co-teelt bevordert de overkolonisatie van weefsel explantaten door A. tumefaciens en vermindert over het algemeen de efficiëntie van de transformatie. Om te voorkomen dat overkolonisatie door A. tumefaciens is het ook belangrijk om regelmatig de platen waarop de explantaten worden geteeld vernieuwen. In het geval dat overkolonisatie optreedt, kunnen weefsel explantaten worden gewassen (zie paragraaf 3,8) om een. tumefaciens cellen te verwijderen. Wij adviseren het toevoegen van bleekwater aan de SH-10 oplossing die wordt gebruikt voor het wassen (uiteindelijke concentratie: ~ 2% hypochloriet). Het is belangrijk op te merken dat deze extra wasstap mogelijk niet werkt op zwaar geïnfecteerde explantaten (Figuur 2b). In het geval dat een transformatie met een CRISPR/Cas9-constructie slechts een beperkt aantal van putge-getransformeerde scheuten oplevert of als mutagenese van een bepaald gen naar verwachting problemen in de regeneratie veroorzaakt, is het raadzaam om een lege Vector controle constructie op te nemen als de positieve controle. Tot slot is het belangrijk ervoor te zorgen dat alle geselecteerde transgene lijnen voortvloeien uit onafhankelijke T-DNA-integratie gebeurtenissen. Daarom geven we opdracht om slechts één putatief-transgene shoot van elke kant van een explant te nemen. We beseffen echter dat dit het potentiële aantal onafhankelijke lijnen vermindert. Als er veel lijnen nodig zijn, kunnen onderzoekers besluiten om putatief getransformeerde Calli van de oorspronkelijke explantaten te scheiden wanneer deze Calli ≥ 2 mm groot zijn en deze Calli onafhankelijk van elkaar. Op deze manier kunnen meerdere lijnen worden geïsoleerd van elke explant, wat het aantal potentiële transgene lijnen verhoogt.
In het huidige protocol worden transgene lijnen van P. andersonii vegetatief vermeerderd door middel van in vitro vermeerdering. Het voordeel hiervan is dat veel transgene plantlets in een relatief korte tijdsperiode kunnen worden gegenereerd. Deze methode heeft echter ook een aantal beperkingen. Ten eerste, het onderhoud van T0 transgene lijnen door in vitro propagatie is arbeidsintensief en kan resulteren in ongewenste genetische of epigenetische wijzigingen34,35. Ten tweede bevatten T0 -lijnen nog steeds een kopie van het T-DNA, inclusief de antibioticaresistentie cassette. Dit beperkt het aantal mogelijke hertransformaties, omdat er voor elke hertransformatie verschillende selectiemarkeringen nodig zijn. Momenteel hebben we alleen transformatie getest met behulp van kanamycine of hygromycine selectie (gegevens niet weergegeven). Bovendien compliceert de aanwezigheid van de Cas9-encoding sequentie en sgRNAs in de T0 transgene lijnen complementatie studies. Complementatie testen zijn mogelijk, maar vereisen dat de sgRNA doelsite (s) als zodanig worden gemuleerd dat genbewerking van de complementatie constructie wordt voorkomen. Ten derde, een nadeel van het werken met T0 lijnen is dat crispr/Cas9 mutanten misschien Chimeric. Om fenotypische analyse van chimeer Mutant Lines te voorkomen, raden we aan om de genotypering te herhalen na in vitro vermeerdering op minstens 3 verschillende scheuten. Hoewel, het aantal chimeer mutanten verkregen met behulp van het protocol hier beschreven is beperkt, ze worden soms waargenomen10. Om de beperkingen van het werken met T0 lijnen te overwinnen, konden P. andersonii mutanten lijnen generatief worden vermeerderd. P. andersonii bomen zijn tweehuizig en wind-bestuikte2. Dit betekent dat elke transgene lijn zo moet worden gemanipuleerd dat mannelijke en vrouwelijke bloemen worden geproduceerd op één individu, en vervolgens als zodanig worden gekweekt dat kruisbestuiving niet optreedt. Aangezien P. andersonii een snel groeiende boom is, is er een aanzienlijke hoeveelheid ruimte nodig in een tropische kas (28 °c, ~ 85% relatieve vochtigheid). Daarom, hoewel technisch mogelijk, generatieve voortplanting van P. andersonii transgene lijnen is logistisch uitdagend.
In het protocol sectie, we beschreven 3 methoden voor is van P. andersonii. Het voordeel van de plaat-en Pouch-systemen is dat de wortels gemakkelijk toegankelijk zijn, wat de spot-inoculatie van bacteriën mogelijk maakt en de knobbel vorming na verloop van tijd kan volgen. Het plaat systeem is echter vrij arbeidsintensief, waardoor het minder geschikt is voor grootschalige is experimenten. Een nadeel van het buidel systeem is dat het moeilijk is om schimmel besmetting te voorkomen. Zakjes zijn niet steriel en daarom wordt schimmelgroei vaak waargenomen op de bovenste helft van het opvangzakje. Echter, dit heeft geen invloed op P. andersonii groei, en daarom niet interfereren met is testen. Bovendien is het opvangsysteem alleen geschikt voor zaailingen. Ondanks verschillende pogingen hebben we geen plantlets kunnen kweken die verkregen zijn door in vitro voortplanting in zakjes.
De P. andersonii reverse genetica pijpleiding beschreven hier biedt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de bestaande a. rhizogenesgebaseerde root transformatie methode11. Met behulp van de beschreven procedures kunnen stabiele transgene lijnen efficiënt worden gegenereerd en kunnen worden gehandhaafd via in-vitro vermeerdering. Daarentegen, A. rhizogenes transformatie is van voorbijgaande aard en resulteert alleen in de vorming van transgene wortels. Omdat elke transgene wortel voortvloeit uit een onafhankelijke transformatie, lijden A. op transformatie gebaseerde assays van rhizogenes aan een aanzienlijke fenotypische variatie. Deze variatie is veel minder in het geval van stabiele lijnen, hoewel in vitro propagatie ook een zekere mate van variatie creëert. Vanwege deze verminderde variatie en het feit dat meerdere plantlets voor elke stabiele lijn fenogetypt kunnen worden, zijn stabiele lijnen geschikter voor kwantitatieve testen in vergelijking met A. rhizogenes-getransformeerde wortels. Bovendien is de stabiele transformatie niet afhankelijk van de introductie van de A. rhizogenes wortel inducerende Locus (rol) die van invloed is op de endogene hormoonbalans15. Daarom zijn stabiele lijnen beter geschikt voor omgekeerde genetische analyse van genen die betrokken zijn bij hormoon homeostase in vergelijking met A. rhizogenes-getransformeerde wortels. Een meer algemeen voordeel van P. andersonii als onderzoeksmodel is dat het niet een recente hele genoom duplicatie (wgd) ervaren. De subfamilie van de Vlinderbloemigen Papilionoideae, met het model peulvruchten M. truncatula es L. japonicus, evenals de Salicaceae (orde Malpighiales) met de model boom Populus balsem ervaren wgds ~ 65 miljoen jaar geleden36,37. Veel van de door deze wgds resulterende paralogous gen kopieën worden bewaard in de genomen van M. truncatula, L. japonicus es P. balsem37,38,39, die redundantie die omgekeerde genetische analyses mogelijk compliceren. Aangezien p. andersonii een recente wgd niet heeft ervaren, zou een omgekeerde genetische analyse op P. andersonii mogelijk minder worden beïnvloed door de redundante werking van de kopieën van paralogous gen.
Samen bieden we een gedetailleerd protocol voor omgekeerde genetische analyse in P. andersonii. Met dit protocol kunnen enkelvoudige mutanten lijnen efficiënt worden gegenereerd in een tijdsbestek van 2-3 maanden10. Dit protocol kan worden uitgebreid om hogere orde mutanten te creëren door multiplexing van sgrna’s die zich richten op verschillende genen tegelijk, zoals getoond voor andere plantensoorten40,41,42. Bovendien is de hier beschreven stabiele transformatie procedure niet beperkt tot het gebruik van CRISPR/Cas9 gentargeting, maar kan ook worden gebruikt om andere soorten constructies te introduceren (bijv. voor promotor-reporter assays, ectopische expressie of trans– complementatie). We hebben P. andersonii opgericht als een vergelijkend onderzoeksmodel om mutualistische symbiose te bestuderen met stikstoffixatie van Rhizobia of endomycorrhizaschimmels fungi. De hier beschreven protocollen bieden echter ook hulpmiddelen om andere aspecten van de biologie van deze tropische boom te bestuderen, zoals houtvorming, de ontwikkeling van bi-seksuele bloemen of de biosynthese van Cannabaceae-specifieke secundaire metabolieten.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen Mark Youles, Sophien Kamoun en Sylvestre Marillonnet voor het maken van Golden Gate kloon onderdelen beschikbaar via de Addgene database. Daarnaast willen we E. James, P. Hadobas en T. J. Higgens bedanken voor p. andersonii zaden. Dit werk werd gesteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-open Competition Grant 819.01.007) en het ministerie van onderzoek, technologie en hoger onderwijs van de Republiek Indonesië (RISET-PRO Grant 8245-ID).
Sigma-Aldrich | N0640 | NAA |
Duchefa Biochemie | M1503.0250 | MES |
Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
Duchefa Biochemie | X1402.1000 | X-Gal |
Merck | 101236 | For nucleic acid electrophoresis gel |
– | – | Pouches box material, hangers |
Merck | 101188 | NH4NO3 |
Sigma-Aldrich | B3408-1G | BAP |
Merck | 100156 | H3BO3 |
Thermo-Fisher | ER1011 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | 15561020 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 137101 | CaCl2·2H2O |
Duchefa Biochemie | C0111.0025 | C16H16N5O7S2Na |
Thermo-Fisher | K1231 | Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure |
Agronutrition | AP2011 | Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay |
Merck | 102790 | CuSO4·5H2O |
Duchefa Biochemie | D1004.1000 | Used for plant tissue culture agar-based medium |
Merck | 105101 | K2HPO4 |
VWR Chemicals | 20302.293 | Na2·EDTA |
Duchefa Biochemie | M0803.1000 | C6H14O6 |
Thermo-Fisher | ER0291 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 100983 | C2H5OH |
VWR Chemicals | BDH9232-500G | EDTA |
Sigma-Aldrich | Z377600-1PAK | Cellophane membrane |
Biomatters, Ltd. | R9 or higher | Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs |
Mega International | – | Technical information at https://mega-international.com/tech-info/ |
Sigma-Aldrich | 65882 | Used for fixating nodule tissues |
VWR Chemicals | 24385.295 | – |
Vink | 219341 | Pouches box material, bottom part |
Leica Biosystems | 14702218311 | Used as a template for plastic embedding |
Merck | 100317 | HCl |
Sigma-Aldrich | I5386-1G | IBA |
Merck | 103862 | C6H5FeO7 |
Merck | 103965 | FeSO4O·7H2O |
Duchefa Biochemie | I1401.0005 | IPTG |
Duchefa Biochemie | K0126.0010 | |
Sigma-Aldrich | L2000 | |
Merck | 105886 | MgSO4O·7H2O |
Merck | 105934 | MnCl2·4H2O |
Merck | 102786 | MnSO4O |
Duchefa Biochemie | M1002.1000 | Used for bacterial culture agar-based medium |
Manutan | 92007687 | Pouches material |
Paraxisdienst | 130774 | Elastic sealing foil |
Pull Rhenen | Agra-Perlite No.3 | Used as growing substrate in pots for nodulation assay |
VWR Chemicals | 391-0581 | Used as container for cellophane membranes |
Thermo-Fisher | F130WH | For genotyping transgenic lines |
Addgene | 50337 | Level 0 terminator, 3’UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus) |
Addgene | 48017 | End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48018 | End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48001 | Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation |
Addgene | 48007 | Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation |
Addgene | 50268 | Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5’UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus) |
Addgene | 46966 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 46968 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 50334 | Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette |
Topzeven | – | Used as filters for washing spore suspension |
Sigma-Aldrich | 8.17003 | PEG400 |
Duchefa Biochemie | E1674.0001 | Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings |
Merck | 104871 | KH2PO4 |
Merck | 105033 | KOH |
Merck | 105153 | K2SO4O |
Van Leusden b.v. | – | Used as growing substrate for mychorrhization assay |
Duchefa Biochemie | S0225.0050 | SH-basal salt medium |
Duchefa Biochemie | S0411.0250 | SH-vitamin mixture |
Lehle Seeds | VIS-02 | Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation |
Merck | 137017 | NaCl |
VWR Chemicals | 89230-072 | C6H11NaO7 |
Merck | 106521 | Na2MoO4·2H2O |
Merck | 106574 | Na2HPO4·7H2O |
Merck | 567549 | NaH2PO4·H2O |
Sigma-Aldrich | 239313 | Na2SO4O |
Duchefa Biochemie | S0809.5000 | C12H22O11 |
Thermo-Fisher | B69 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | EL0013 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64708806 | Methyl methacrylate-based resin powder |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64709003 | HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 66022678 | Methyl methacrylate-based resin solution |
Merck | 1159300025 | |
Acros | 189350250 | |
VWR Chemicals | 663684B | Polysorbate 20 |
Stout Perspex | – | pouches box material, lid |
Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Merck | 108816 | ZnCl2 |
Alfa Aesar | 33399 | ZnSO4O·7H2O |