Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü
Summary
Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.
Abstract
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) 1990’ların ortalarında kombine antiretroviral tedavi (cART) getirilmesine rağmen önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Antiretroviral tedavi sistemik viral yükü etkin bir şekilde düşürürken ve normal CD4+ T hücre sayılarını geri getirirken, tamamen işlevsel bir bağışıklık sistemini yeniden oluşturmaz. CART uygulanan HIV-enfekte bireylerde işlevsiz bir bağışıklık sistemi bağışıklık aktivasyonu ile karakterize olabilir, bağışıklık hücrelerinin erken yaşlanma, ya da kalıcı inflamasyon. Bu koşullar, HIV enfeksiyonu ile ilişkili komorbid faktörler ile birlikte, kolayca hücresel ve hayvan modellerinde çoğaltılamaz hastalık, karmaşıklık ekleyin. Bu hastalarda immün disfonksiyonun altında yatan moleküler olayları araştırmak için, insan primer monositlerini in vitro olarak manipüle eden bir sistem sunulmuştur. Özellikle protokol, cART uygulanan HIV bulaşmış bireylerden ve HIV-negatif kontrollerden elde edilen birincil CD14+ monositlerin kültür ve transfeksiyonuna olanak sağlar. Yöntem, monositlerin ve monosit kaynaklı makrofajların izolasyon, kültür ve transfeksiyonu içerir. Ticari olarak mevcut kitler ve reaktifler kullanılırken, protokol miRNA mimikleri ve inhibitörleri ile monositlerin başarılı bir şekilde yapışması ve transfeksiyonu için önemli ipuçları ve optimize edilmiş koşullar sağlar.
Introduction
İnsan immün yetmezlik virüs-1 (HIV-1) enfeksiyonu fırsatçı enfeksiyonlara ve edinsel immün yetmezlik sendromuna (AIDS) yol açabilen ciddi immün fonksiyon bozukluğuna neden olur. Hiv-enfekte hastalar cART geçiren düşük viral yükler ve normal CD4+ T hücre sayıları ile karakterize olmasına rağmen, bağışıklık sisteminin işleyişi bu kişilerde tehlikeye olabilir, kanser gelişme riski ile bağlantılı olan işlevsiz bir bağışıklık yanıtına yol açan1. CART’taki HIV hastalarında immün disfonksiyon mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu nedenle, hasta kaynaklı bağışıklık hücrelerinin karakterize ve biyoloji ve fonksiyon araştırılması mevcut HIV araştırmanın önemli bir bileşenidir.
Monositler ve makrofajlar bağışıklık yanıtlarının temel düzenleyicileridir ve HIV enfeksiyonu2,3,4,5’tetemel rol oynarlar. Heterojen ve plastik doğada makrofajlar klasik olarak aktive (M1) veya alternatif olarak aktive (M2) olarak sınıflandırılabilir. Deneysel koşullar belirlenirken bu genel sınıflandırma gerekli olmakla birlikte, makrofajların polarizasyon durumu çeşitli sitokinler6,7,8,9ile tersine çevrilebilir. Çeşitli çalışmalar monositler ve dendritik hücreler üzerinde HIV enfeksiyonu etkilerini araştırmış olsa da, monosit aracılı yanıtların moleküler detayları büyük ölçüde bilinmemektedir6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Bağışıklık hücresi regülasyonu ve fonksiyonu ile ilgili faktörler arasında, mikroRNA’lar (miRNA’lar), transkripsiyon sonrası gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan RNA’ların, büyük hücresel yollar (yani büyüme, farklılaşma, gelişme ve apoptoz) bağlamında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir20. Bu moleküller, makrofajların fonksiyonel polarizasyonunu dikte etmek için gerekli transkripsiyon faktörlerinin önemli düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır21. CART uygulanan HIV enfekte bireylerin monositlerde miRNA potansiyel rolü araştırılmıştır, ancak alanında ilerleme çok daha fazla çalışma gerektirir22,23,24,25,26. Bu makalede, miRNA’ları ve siRNA’ları HIV ile enfekte olmuş hastalardan ve kontrollerden birincil insan monositlerine dönüştürmek için optimize edilmiş bir yöntem tartışılmaktadır.
Bu protokol, teknik prosedürdeki süreklilik klinik numunelerle çalışırken gereksiz deneysel değişkenlerin ortadan kaldırılmasına yardımcı olduğu için, ticari olarak kullanılabilen reaktiflere ve kitlere dayanır. Bununla birlikte, yöntem önemli ipuçları sağlar (yani, plaka hücrelerinin yapışmasını teşvik etmek için serumsuz medya ile kaplanmış veya kısa kuluçka hücre sayısı). Ayrıca, bu protokolde kullanılan polarizasyon koşulları yayınlanan çalışma27,28,29türetilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokol, monosit ve makrofajların incelenmesinde bir model olarak HIV ile enfekte olmuş deneklerin birincil hücrelerinin kullanımını göstermektedir. HIV+ cART geçiren hastalar birden fazla yıl enfeksiyon ile yaşamak ve aynı zamanda diğer co-enfeksiyonlar tehlikeye bağışıklık sistemi ile ilgili olabilir. HIV kronik enfeksiyon varlığında immünomodülasyon çalışma için, hücreler doğrudan hastalardan hasat edildi. MiRNA’ların hücre gelişimi ve farklılaşmasında önemli rol …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar hiv Klinik / Tümör Biorepozitory Core hasta örnekleri ve hücresel immünoloji metabolizma çekirdek akış sitometri analizi sağlamak için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje NIH P20GM121288 ve P30GM114732 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
Referencias
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Investigación sobre el cáncer. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
