이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.
간 조직의 재생 가능한 소스의 개발은 세포 기반 모델링을 개선 하는 데 필요한, 이식에 대 한 인간의 조직을 개발. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)는 인간 간 구체의 유망한 소스를 나타냅니다. 우리는 인간 다능성 줄기 세포에서 형성된 3차원 인간 간 구체를 생성하기 위해 세포 분화의 무혈청 및 정의된 방법을 개발했습니다. 기술의 잠재적 인 한계는 내부에 죽은 물질과 조밀 한 구체의 생산이다. 이를 우회하기 위해, 우리는 3D 구체의 크기를 제어하기 위해 정의 된 세포 밀도에서 agarose 마이크로 웰 기술을 채택하여 세포 사멸 및 / 또는 괴사 코어의 생성을 방지했습니다. 특히, 우리의 접근 방식에 의해 생성 된 구체는 간 기능과 안정적인 표현형을 표시, 기본 및 응용 과학 연구를위한 귀중한 자원을 나타내는. 우리는 우리의 접근이 인간적인 질병을 모형하고 취급하기 위하여 추가 조직을 개발하는 플랫폼 기술로 이용될 수 있고 미래에 복잡한 조직 건축을 가진 인간 조직의 생성을 허용할 수 있다는 것을 믿습니다.
다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 능력은 다능성을 유지하면서 자가 갱신하는 동시에 필요에 따라 인간 세포 유형과 조직을 생산 할 수있는 기회를 제공합니다. hPSC는 2차원(2D) 부착 배양 시스템1,2,3,4,5,6을 사용하여 간세포형 세포(HLCs)로 효율적으로 분화되었습니다. ,7,8,9,10. 이러한 시스템은 단원성 질환, 바이러스 수명 주기, 약물 유발 간 손상(DILI), 독소 및 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)에 대한 태아 노출(NAFLD)11,12,13을 성공적으로 모델링하는 데 사용되었습니다. ,14,15. 그러나 이러한 모델에는 일상적인 사용을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다. 이들은 태아 마커 발현, 불안정한 표현형 및 가난한 조직 건축16,17,18,19를포함하며, 이는 또한 생체 내에서 장기 기능에 대한 외삽을 제한할 수 있다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 3차원(3D) 분화 플랫폼은 생체 내 조직 구조를 모방하기 위해 개발되었다. 비록 가능하게, 그 접근은 조직 창세기20,21,22를구동하기 위하여 동물 유래 제품 및 매트릭스의 사용에 의존합니다, 확장 및 광범위한 신청을 제한하.
여기서는 정의된 재료 및 셀 자체 어셈블리를 사용하여 hPSC에서 대량의 3D 간구를 생성하는 절차를 자세히 설명합니다. 특히, 우리의 시술에 의해 생성된 조직은 세포 배양에서 1년 이상 기능적으로 유지되며 생체내 간 기능을 지원할 수 있다23.
요약하자면, 우리의 정의된 분화 접근법은 인간 배아 줄기 세포(hESCs) 및 유도만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 안정적인 인간 간구의 생성을 허용한다. 우리는 설명된 절차가 기본 및 응용 과학 연구를 위한 3D 간구의 생성에 있는 중요한 돌파구를 나타낸다고 믿습니다.
3D로 인간 간구를 생산하기 위해 정의된 제노 프리 시스템의 개발은 시험관 내 및 생체 내 노력 모두에 필요합니다. 현재 대부분의 간세포 분화 접근법은 인간 만능 줄기 세포로부터2차원 부착 배양으로 수행된다. 이러한 환경은 조직 기원 및 항상성에 관여하는 많은 환경 단서가 부족합니다. 이종 세포 상호 작용, 매트릭스 생산 및 리모델링, 생체 내 생물학에 가난한 번역의 결과18,19.
그 결과, 연구는 다능성 줄기 세포에서 간구를 생성하는 대체 접근법에 초점을 맞추고있다. 3D 연구의 숫자는 필드를 진행했지만, 그 지원 및 / 24를 제공하기 위해 동물 성 제품에 의존21,22 복잡 기술 확장 및 실험 재현성 및 응용 프로그램을 손상시고 있습니다.
당사의 기사(그림1)에 설명된 절차는 정의되고, 효율적이며, 매우 재현가능하며 비용 효율적이며, 시험관 내에서 1년 동안 기능적으로 유지되고 중요한 간 지원을 제공하는 기능성 간 구체의 생산을 허용합니다. 생체 내14. 중요한 것은,이 플랫폼은 사용자가 조밀 한 괴사 센터의 형성과 표현형의 손실을 제한, 3D 간 구체의 크기를 제어 할 수 있습니다.
3D 간구를 폴리-HEMA 코팅 플레이트로 의전하는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계를 나타낸다. 구가 손상되지 않도록 절차에서이 단계에서 부드럽게 파이펫하는 것이 중요합니다. 또한 구 구조의 전단 응력과 왜곡을 방지하기 위해 미디어 변경을 신중하게 수행해야 합니다.
이러한 연구에서, 3D 간구는 조직화된 구조를 나타내었다(도2 및 도3), 시토크롬 P450 기능(도4)및 알부민 및 알파-페토프로테인을 포함하는 분비간 단백질(도 5). 이 절차는 성공적으로 비교 결과를 가진 4개의 만능 줄기 세포 선에서 수행되었습니다. 앞을 내다보면서, 이 기술은 복잡한 아키텍처를 가진 추가 내피 및 중간엽 조직을 개발하는 플랫폼으로 이용될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 영국 재생 의학 플랫폼 (MRC MR / L022974 / 1)과 수석 과학자 사무실 (TCS / 16 /37)의 상으로 지원되었습니다.
Cell Culture and functional assays | |||
Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Equipment | |||
Microwave | Bosch | ||
Microtome | Leika | RM2125RT | |
Oven | Thermoscientific | ||
Antibodies | |||
Primary antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |