Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas frágeis de X, por exemplo, a síndrome do tremor e da ataxia (FX-TAS), e a insuficiência ovariana preliminar (FX-POI) são causadas principalmente pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) nos 5 ‘ não traduzidos região (UTR) do gene frágil X retardo mental-1 (FMR1) no xq 27,3^1,2. A proteína FMR1 codificada (FMRP) é uma proteína de ligação de RNA associada a poliribosome que funciona no desenvolvimento neuronal e na plasticidade sináptica, regulando a emenda alternativa, estabilidade e transporte dendrítico de mRNA ou síntese moduladora de proteínas pós-sinápticas parciais^3,4,5,6,7.

A variação dinâmica com um tamanho da repetição de CGG de > 200 é descrita como a mutação cheia, que induz o hipermetilação aberrante e o silenciamento transcricional subseqüente do promotor FMR1 ⁸. A ausência ou falta resultante da proteína FMRP interrompe o desenvolvimento neuronal normal e provoca o FXS⁹, caracterizado por vários sintomas clínicos, incluindo incapacidade intelectual moderada a grave, atraso no desenvolvimento, comportamentos hiperativos, contatos pobres e manifestações autísticas^10,11,12. A apresentação em pacientes fêmeas de FXS é geralmente mais suave do que aquela nos machos. O tamanho da repetição de CGG que varia de 55 a 200 e de 45 a 54 é classific como a pré-mutação e o status intermediário, respectivamente. Devido ao alto grau de instabilidade, o tamanho da repetição de CGG em uma pré-mutação ou alelo intermediário presumivelmente se expande quando transmitido dos pais para a descendência^13,14. Assim, os portadores com alelos da pré-mutação estão no risco elevado de ter as crianças afetadas com o FXS por causa da expansão da repetição, e em alguns casos, os alelos intermediários podem expandir seu tamanho da repetição à escala cheia da mutação sobre duas gerações^15, a ¹⁶. Além disso, os machos com pré-mutação também transmitem um risco aumentado de desenvolvimento de FX-tas de início tardio^{17,18,19, enquanto}as^{fêmeas de}pré-mutação são predispostas para FX-tas e FX-POI^{20, 21,22}. Recentemente, tem sido relatado que distúrbios do espectro autístico com atraso no desenvolvimento e problemas em comportamentos sociais são apresentados em crianças com pré-mutação FMR1 alelos^23,24.

Para determinar o tamanho exato da repetição de CGG é de grande importância para classificação e predição do FXS e de desordens X-associadas frágeis^25,26. Historicamente, a reação em cadeia da polimerase específica da região de repetição CGG (PCR) com dimensionamento de fragmento mais a análise do Southern blot tem sido o padrão-ouro para o perfil molecular da repetição de FMR1 CGG²⁷. Entretanto, o PCR específico tradicional é menos sensível às grandes pré-mutações com mais de 100 a 130 repetições e é incapaz de amplificar mutações cheias^27,28. Além disso, a electroforese capilar em um analisador genético tradicional para o dimensionamento da repetição não detecta produtos de FMR1 PCR com mais de 200 repetições de CGG. A análise do Sul do borrão permite a diferenciação de uma escala mais larga do tamanho da repetição, de normal aos números inteiros da repetição da mutação, e foi amplamente utilizada confirmando mutações cheias (nos machos) e diferenciando alelos heterozygous com uma mutação cheia de alelos aparentemente homozygous com tamanhos normais da repetição (nas fêmeas). No entanto, a resolução para quantificar as repetições é limitada. Mais importante, esta estratégia de teste passo a passo é trabalhosa, demorada, e custo-ineficaz.

Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da PCR-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ‘ UTR do promotor FMR1 usando o jogo frágil do PCR de X. Os produtos do PCR são purified e o dimensionamento do fragmento é executado em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e na interpretação subseqüente do número de repetições de CGG usando o software da análise referenciando padrões com repetições conhecidas baseadas no racional que o comprimento do fragmento do PCR é diretamente proporcional ao número de repetições de CGG. O sistema do PCR inclui os reagentes que facilitam a amplificação da região altamente GC-rica da repetição do trinucleotide. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar todas as escalas de repetições de CGG de FMR1 promotores. Este é um método rentável que pode encontrar a aplicação larga no diagnóstico molecular e na seleção do FXS e de desordens X-relacionadas frágeis com menos tempo do turn-around e o investimento no equipamento e assim, pode ser utilizado em um espectro mais largo de clínico Laboratórios.