Identifisering av mutasjoner ved høy oppløsning smelting i en TILLING befolkning på Rice
Summary
I denne artikkelen presenterer vi protokollen som er beskrevet som høy oppløsning smelte analyse (HRM)-basert Target indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING). Denne metoden utnytter fluorescens endringer under smelting av DNA dupleks og er egnet for høy gjennomstrømming screening av både innsetting/sletting (Indel) og enkelt base substition (SBS).
Abstract
Target indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) er en strategi for omvendt genetikk for høy gjennomstrømming screening av indusert mutasjoner. Imidlertid, det TILLING system har færre anvendelighet for innsettingen/overstrekingen (Indel) oppdagelsen og tradisjonell TILLING nødvendig flere innviklet skritt, like CEL jeg nuklease oversikten og gel elektroforese. For å forbedre gjennomstrømningen og valg effektivitet, og for å gjøre screening av både indeler og enkelt base substitions (SBSs) mulig, utvikles et nytt høyoppløselig smelte (HRM)-basert TILLING-system. Her presenterer vi en detaljert HRM-TILLING protokoll og vise sin anvendelse i mutasjon screening. Denne metoden kan analysere mutasjoner av PCR-amplicons ved å måle denaturering av dobbelt strandet DNA ved høye temperaturer. HRM-analyse er direkte utført post-PCR uten ekstra behandling. Videre er en enkel, sikker og rask (SSF) DNA utvinningsmetode integrert med HRM-TILLING for å identifisere både indeler og SBSs. Dens enkelhet, robusthet og høy gjennomstrømning gjør det potensielt nyttig for mutasjon skanning i ris og andre avlinger.
Introduction
Mutanter er viktige genetiske ressurser for anlegget funksjonell Genomics forskning og oppdrett av nye varianter. En frem genetikk tilnærming (dvs. fra mutant utvalg til gen kloning eller variasjon utvikling) pleide å være den viktigste og eneste metoden for bruk av indusert mutasjoner ca 20 år siden. Utviklingen av en roman omvendt genetikk metode, TILLING (målretting indusert lokale lesjoner i genomer) av McCallum et al.1 åpnet et nytt paradigme, og det har siden blitt brukt i et stort antall dyr og plantearter2. TILLING er spesielt nyttig for avl trekk som er teknisk vanskelig eller kostbart å bli bestemt (f. eks, sykdomsresistens, mineral innhold).
TILLING ble opprinnelig utviklet for screening punkt mutasjoner indusert av kjemiske mutagener (f. eks, EMS1,3). Det inkluderer følgende trinn: etablering av en TILLING befolkning (s); DNA forberedelse og pooling av individuelle planter; PCR forsterkning av mål DNA-fragment; heteroduplexes formasjon ved denaturering og annealing av PCR-amplicons og kløft av CEL I nuklease; og identifisering av mutant individer og deres spesifikke molekylære lesjoner3,4. Denne metoden er imidlertid fortsatt relativt komplisert, tidkrevende og lav gjennomstrømming. For å gjøre den mer effektiv og med høyere gjennomstrømming, har mange modifiserte TILLING metoder blitt utviklet, slik som sletting TILLING (de-TILLING) (tabell 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
HRM kurve analyse, som er basert på fluorescens endringer i løpet av smelting av DNA dupleks, er en enkel, kostnadseffektiv, og høy gjennomstrømming metode for mutasjon screening og genotyperingteknologi13. HRM har allerede vært mye brukt i anlegget forskning inkludert HRM basert TILLING (HRM-TILLING) for screening SBS mutasjoner indusert av EMS mutagenese14. Her presenterte vi detaljerte HRM-TILLING protokoller for screening av mutasjoner (både Indel og SBS) indusert av gamma (γ) stråler i ris.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING har vist seg å være et kraftig omvendt genetisk verktøy for å identifisere induserte mutasjoner for gen funksjonell analyse og avling avl. For noen egenskaper som ikke lett observeres eller bestemmes, kan TILLING med høy gjennomstrømming PCR-basert mutasjon-deteksjon være en nyttig metode for å få mutanter for ulike gener. HRM-TILLING metoden har blitt brukt i EMS-mutagenized bestander av tomat12, hvete11 og Grapevine20 for mutasjon …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av det nasjonale nøkkel forsknings-og utviklingsprogrammet i Kina (no. 2016YFD0102103) og det nasjonale natur vitenskaps stiftelsen i Kina (no. 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
Referencias
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
