Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

O ensaio do cometa é cada vez mais usado como um meio de avaliar os danos do DNA em células cultivadas e tecidos expostos a produtos químicos ou outros estressores ambientais¹. O ensaio pode detectar quebras de DNA duplo e único, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios únicos associadas ao reparo incompleto do DNA. O Conselho Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para Medicamentos para Uso Humano (ICH) para testes farmacêuticos recomenda um ensaio de quebra de fios de DNA, como o ensaio do cometa como um segundo teste para complementar o ensaio do micronúcleo eritrócito de roedores para avaliação da genotoxicidade in vivo e como um teste de acompanhamento para avaliação do modo de ação em órgãos-alvo de indução de tumor². A Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA) recomenda o ensaio do cometa in vivo como um teste de seguimento adequado para investigar a relevância de um resultado positivo em um teste de genotoxicidade in vitro³. Em 2014, uma diretriz de teste da OCDE foi aprovada para o ensaio do cometa roedor, aumentando assim a aceitação do ensaio para uso em testes regulatórios de potencial genotóxico. O ensaio é baseado na separação eletroforética de laços de DNA relaxados e fragmentos que migram de nucleóides de células lysed. Basicamente, células únicas estão embutidas em agarose que foi colocada em camadas em slides de microscópio. Os slides são então imersos em tampão de lyse seguido de uma solução alcalina (pH > 13), que permite que o DNA nuclear bem enrolado relaxe e descontraa. Os slides são então colocados em um campo elétrico, o que estimula a migração do DNA negativamente carregado em direção ao ânodo, criando imagens que se assemelham a cometas; a quantidade relativa de DNA na cauda do cometa em comparação com a cabeça do cometa é diretamente proporcional à quantidade de dano de DNA; O conteúdo de DNA na cauda é tipicamente quantificado usando software de imagem digital.

Como o ensaio do cometa detecta DNA fragmentado, a quantificação precisa de danos de DNA induzidos por exposição pode ser confundida pela fragmentação da cromatina associada à necrose ou apoptose resultante de citotoxicidade ou estresse induzidos pelo tratamento. Além disso, danos no DNA podem ocorrer como resultado de cisalhamento mecânico ou processamento inadequado da amostra⁴. A importância de manter o tecido colhido refrigerado antes da preparação do slide para minimizar o nível de base de dano de DNA foi previamente demonstrada^5,6. Muitos laboratórios preparam slides de ensaio sinuosos de tecido fresco; no entanto, isso pode ser logisticamente desafiador ao preparar slides de múltiplos tipos de tecidos por animal em um estudo com um grande número de animais. Além disso, apresenta um problema quando a preparação e análise de slides devem ocorrer em um laboratório remoto, necessitando de remessa de amostras. Por exemplo, o Programa Nacional de Toxicologia dos EUA inclui o ensaio do cometa como um componente de seu programa de testes toxicológicos genéticos (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) e às vezes incorpora o ensaio em estudos de toxicidade de repetição de 28 ou 90 dias; isso requer a coleta de tecidos pelo laboratório em vida e a transferência de amostras para outro laboratório para análise. Para isso, as peças de tecido são picadas e/ou células epiteliais do trato gastrointestinal são raspadas e as suspensões celulares são congeladas e armazenadas em um congelador para posterior embarque e armazenamento pelo laboratório receptor até a análise⁷. O manuseio adequado das amostras é crucial para a obtenção de dados de alta qualidade utilizando tecido congelado; no entanto, a manipulação reprodutível de amostras de tecidos durante necropsias realizadas por pessoas em constante mudança é difícil de controlar, especialmente em laboratórios em vida que não coletam tecidos rotineiramente para o ensaio do cometa. O treinamento de atualização da equipe de necropsia ou o uso de uma unidade móvel com pessoal de laboratório experiente para coletar amostras de tecido fresco ou congelado é muitas vezes muito caro, inviável ou simplesmente desvalorizado.

Para garantir melhor a geração consistente de amostras de tecido de alta qualidade para transferência para um local remoto para análise de ensaios de cometas, foi explorada a utilidade de um método publicado⁶ de preservação de tecidos a partir de cubos de tecido congelados flash. Neste método, cubos congelados de tecido são carregados em um dispositivo de picar tecido de aço inoxidável(Figura 1) que é colocado em um tubo de microcentrífuga contendo tampão frio. O cubo de tecido é então empurrado através de uma pequena malha de bitola na extremidade do dispositivo. Forçar repetidamente a suspensão do tecido através da peneira de malha em ambas as direções várias vezes resulta em uma suspensão celular única relativamente uniforme. Amostras preparadas por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar. Como um benefício adicional, ao contrário das amostras picadas, os cubos de tecido podem ser armazenados congelados por períodos prolongados de tempo e ainda produzir resultados de alta qualidade no ensaio do cometa.