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Bioquímica

Étiquetage métabolique extrêmement rapide et spécifique de l'ARN In Vivo avec 4-Thiouracil (Ers4tU)

Published: August 22, 2019
doi:
10.3791/59952
,
1Wellcome Centre for Cell Biology, School of Biological Sciences,University of Edinburgh

Summary

L’utilisation de l’uracil thiolated pour purifier avec sensibilité et spécifiquement l’ARN nouvellement transcrit de la levure Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

L’analogue nucléotide, 4-thiouracil (4tU), est facilement pris en charge par les cellules et incorporé dans l’ARN car il est transcrit in vivo, permettant l’isolement de l’ARN produit au cours d’une brève période d’étiquetage. Ceci est fait en attachant un moiety de biotine au groupe incorporé de thio et à la purification d’affinité, utilisant des perles enduites de streptavidin. L’obtention d’un bon rendement de l’ARN pur et nouvellement synthétisé qui est exempt de l’ARN préexistant permet des temps d’étiquetage plus courts et permet une résolution temporelle accrue dans les études cinétiques. Il s’agit d’un protocole pour la purification très spécifique et à haut rendement de l’ARN nouvellement synthétisé. Le protocole présenté ici décrit comment l’ARN est extrait de la levure Saccharomyces cerevisiae. Cependant, le protocole pour la purification de l’ARN thiolé de l’ARN total devrait être efficace en utilisant l’ARN de n’importe quel organisme une fois qu’il a été extrait des cellules. L’ARN purifié est approprié pour l’analyse par beaucoup de techniques largement utilisées, telles que transcriptase-qPCR inversé, RNA-seq et SLAM-seq. La spécificité, la sensibilité et la flexibilité de cette technique permettent des connaissances inégalées sur le métabolisme de l’ARN.

Introduction

L’ARN a une nature dynamique; peu de temps après sa production, beaucoup d’ARN est rapidement traité et dégradé. Actuellement, la plupart des études du métabolisme de l’ARN analysent l’ARN cellulaire total, qui est la plupart du temps entièrement traité et à un niveau d’état stable. Ce niveau dépend de l’équilibre entre les taux de transcription, de maturation post-transcriptionnelle et de dégradation. L’analyse des processus qui mènent à l’équilibre régulier de l’état nécessite des techniques spécialisées pour capturer des espèces d’ARN de très courte durée.

L’étiquetage métabolique de l’ARN avec des analogues nucléotides tels que 4-thiouracil (4tU) ou 4-thiouridine (4sU) (voir Duffy et al.1 pour un excellent examen), offre la capacité d’isoler les ARN naissants thio-étiquetés et leurs intermédiaires de traitement. Cependant, les protocoles publiés impliquent des temps d’étiquetage de plusieurs minutes2,3, ce qui est lent par rapport au taux de production de nombreuses transcriptions. Il faut de l’ordre d’une minute pour transcrire le gène de levure moyen, de sorte que l’étiquetage de l’ARN de levure pour moins d’une minute peut être considéré comme extrêmement court. Le protocole 4 thiouracil extrêmement rapide et spécifique (ers4tU) maximise le rapport signal/bruit en maximisant l’incorporation 4tU et en minimisant la récupération de l’ARN préexistant non étiqueté, ce qui rend les temps d’étiquetage très courts possibles4.

La base thio-modifiée doit être importée dans les cellules rapidement et en quantité suffisante pour étiqueter efficacement l’ARN nouvellement synthétisé (nsRNA). Pour promouvoir cela, les cellules sont cultivées dans un milieu sans uracil, et l’expression d’une permease appropriée aide à stimuler l’utilisation de 4tU ou 4sU (voir le tableau 1 pour une liste de plasmides qui portent des gènes de permease appropriés et la figure supplémentaire 1). La solubilité de 4tU dans l’hydroxyde de sodium évite le besoin de solvants organiques toxiques requis par d’autres analogues de nucléotide. Malheureusement, on a observé des cultures de plus en plus fortes pendant de longues périodes avecdes nucléosides modifiés à des concentrations supérieures à 50 M. pour perturber les ribosomes 5. Cependant, la concentration (10 m) utilisée ici, et les temps d’étiquetage extrêmement courts, minimisent les effets délétères5 (figure 1a), tout en produisant suffisamment d’ARN pour l’analyse.

Cette technique peut être combinée à un appauvrissement rapide et spécifique d’une protéine cible6,7 ( figure2), appelé le protocole « AID 4U » ( ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ système de dégron inductible (AID) est combiné avec l’étiquetage 4tU. Avec l’approche DE l’AID 4U, une protéine cible peut être épuisée et l’effet sur le métabolisme de l’ARN est étroitement surveillé (Figure 2). Le moment est crucial; il est conseillé de visionner la vidéo d’accompagnement et de porter une attention particulière à la figure 2 et à sa forme animée (voir la figure supplémentaire 2).

Le traitement et la dégradation de l’ARN doivent être arrêtés extrêmement rapidement pour une résolution précise du temps. Ceci est réalisé en utilisant le méthanol à basse température, qui fixe le contenu cellulaire très rapidement et dégrade la membrane cellulaire tout en préservant la teneur en acide nucléique8. L’extraction de l’ARN doit être efficace et ne pas endommager l’ARN. La lyse mécanique est efficace en l’absence d’agents chaotropes (souvent ceux-ci contiennent des groupes de thio, donc doivent être évités). La précipitation de chlorure de lithium de l’ARN est préférée, car les ARNt sont moins efficacement précipités. Les ARNt sont rapidement transcrits et naturellement thiolés9, de sorte que l’élimination des ARNt réduit la concurrence pour le réactif de biotinylation. Si de petites ARN hautement structurées sont intéressantes, des méthodes de précipitation à base d’alcool sont recommandées.

Pour récupérer l’ARN thiolé, la biotine est covalently attachée par l’intermédiaire des groupes de thio incorporés dans l’ARN avec 4tU. L’utilisation de la biotine modifiée, qui se fixe par l’intermédiaire d’une liaison de disulfure clevabable (par exemple, HPDP-biotine (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 –(2 pyridyldithio)propionamide, ) ou MTS-biotine (Méthane thiosulfonate) est recommandée car il permet la libération de l’ARN par l’ajout d’un agent réducter. L’ARN biotinylated est affinité purifiée sur le streptavidin couplé aux perles magnétiques. Ce protocole est similaire à d’autres énumérés précédemment10, mais a été intensivement optimisé pour réduire l’arrière-plan.

Il existe deux types d’expériences d’étiquetage thiol qui peuvent être effectuées, l’étiquetage continu et discontinu. Chacun a ses propres avantages. Dans l’étiquetage continu, le 4tU est ajouté à la culture et les échantillons prélevés à intervalles réguliers. Ce type d’expérience montre comment l’ARN est traité et comment les niveaux changent au fil du temps. Par exemple, la comparaison de mutants avec des expériences de type sauvage et une expérience de chasse aux impulsions. Les expériences présentées dans Figure 3b,c sont de ce type. Pour l’étiquetage discontinu, un changement est induit dans le système et l’ARN surveillé. Une fois que le changement a été induit, la culture doit être divisée en plusieurs sous-cultures, et à des moments précis, chacune est ensuite thio-étiquetée pendant une brève période. Un exemple est l’AID 4U de l’est montré à la figure 27. Ce type d’expérience est particulièrement utile pour surveiller l’effet d’un changement métabolique sur le traitement de l’ARN (voir La figure 3d).

Une représentation graphique d’une expérience de thio-étiquetage est présentée dans la figure 4 et la figure 5, et une feuille de calcul qui simplifie considérablement les performances du protocole est disponible (voir 4tU experiment template.xlsx). En outre, l’information supplémentaire contient un guide de dépannage complet. Pour le protocole AID 4U qui intègre l’étiquetage 4tU au protocole d’épuisement des émadés, voir Figure 2 et Figure 2 supplémentaire. Voir Barrass et coll.7 pour le protocole détaillé d’épuisement de l’AID.

Protocol

1. Croissance et thio-étiquetage REMARQUE : Le temps d’achèvement de cette section du protocole est très variable, selon le taux de croissance cellulaire. Prévoyez 1 h pour préparer les solutions et l’équipement avant le thio-étiquetage et 30 min après l’étiquetage pour traiter les échantillons. Assurez-vous que la souche S. cerevisiae contient un plasmide codant une permease (tableau 1) pour stimuler l’importation de 4tU dans la cellule.REMARQUE : En l’cas d’importateur, il est peu probable que l’étiquetage pour moins de 2 min soit un succès11 (voir la figure supplémentaire 1). L’incorporation 4tU est plus efficace si la croissance est dans le milieu sans uracil, de sorte que la souche doit être URA3; plusieurs des plasmides du tableau 1 portent l’URA3 comme marqueur. Si ce protocole doit être combiné avec l’épuisement de l’AID7,d’autres modifications de la contrainte sont nécessaires. Préparer le milieu sans uracil YMM en ajoutant 6,9 g de base d’azote de levure sans acides aminés, 20 gde glucose et 1,92 g de SCSM unique drop-out(ura) à 1 L d’eau. Autoclave ou filtre stériliser le milieu de croissance avant utilisation.REMARQUE : La stérilisation des filtres est préférable comme complexes peptidiques/sucres produits par l’autoclacnage co-précipité avec les cellules du méthanol utilisé dans la collecte d’échantillons. Cultivez de la levure dans le milieu sans uracil YMM à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,6 à 0,8. Assurez-vous que la culture est en phase de croissance du journal et a été pour au moins deux doublements. La croissance à 30 oC est normalement recommandée, mais d’autres températures peuvent être utilisées, par exemple, pour les souches sensibles à la température.REMARQUE : Selon la souche, les conditions de croissance et le rendement de l’ARN, un volume d’échantillon d’environ 30 ml sera nécessaire. Ce montant sera assumé tout au long du protocole. 30 mL de culture est le plus qui s’adaptera dans un tube de centrifugeuse de 50 ml avec 20 ml de méthanol, est donc un volume pratique pour commencer l’optimisation. Envisagez d’utiliser plus de volume d’échantillon pour les points de temps précoce pour augmenter la récupération de l’ARN, jusqu’à 2000 mL a été utilisé pour les cellules de croissance plus lente à des temps d’étiquetage très courts (lt;1 min). Refroidir environ 50 ml de H2O sur la glace. Pour chaque échantillon, ajouter 200 l de perles de zirconia à un tube à bouchon à vis de 2 ml et refroidir sur la glace. Mettre également 20 ml de méthanol (CAUTION), dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml, et placer sur de la glace sèche (CAUTION). Le méthanol doit être de 1/3 à 2/3 le volume de l’échantillon.CAUTION : Le méthanol est toxique par inhalation, contact et consommation. Distribuez de grands volumes dans une hotte de fumée, et portez deux paires de gants, car le méthanol peut pénétrer les gants de laboratoire nitriles. Le méthanol est très inflammable, éloignez-vous de toutes les sources d’inflammation.REMARQUE : Comme la glace sèche peut causer des brûlures froides au contact et produire du gaz asphixiant, utilisez des gants lors de la manipulation et de l’utilisation dans un espace bien aéré.REMARQUE: L’ajout des perles à ce stade est plus facile qu’après l’échantillon a été ajouté que le tube est sec et lors de la rotation vers le bas de la pastille cellulaire les perles sont également filé clair du fil de tube économiser un certain temps. En outre, cela permet aux perles de refroidir avant l’ajout de l’échantillon. Si un pic de s. pombe doit être ajouté à la culture (plutôt que plus tard), décongelez un aliquot de cellules de S. pombe thiolated sur la glace et le vortex complètement, au moins 30 s, puis ajoutez à la culture. S’il est préparé selon les instructions ci-dessous, un S. pombe aliquot est suffisant pour 400 ml de culture (assez pour douze échantillons de 30 ml plus un peu pour tenir compte des erreurs de manipulation). Si plus ou moins de culture est utilisée, ajuster le volume de S. pombe ajouté à la culture. Cultivez 1 L de s. culture de pombe à OD600 à 0.8 exactement comme décrit dans le protocole pour S. cerevisiae. Thio-label comme étape 1.7, mais pour 10 min. Fixer toute la culture en utilisant 400 ml de méthanol sur la glace sèche, essentiellement comme décrit à l’étape 1.9. Pelleter les cellules par centrifugation à 3000 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 3,3 ml de H2O. Diviser en aliquots de 80 l chacun. Conserver à -80 oC. Utilisez tout un aliquot pour une culture de 400 ml ou 10 l par échantillon de 30 ml.REMARQUE: Réduire le volume de pointe à 1/10 si vous effectuez RNAseq. Ne réutiliser pas les aliquots; jeter toute pointe inutilisée. Ce pic est utile pour normaliser et comparer les résultats à travers les points de temps et les expériences. Pour l’étiquetage discontinu, induisent la perturbation métabolique requise (p. ex., conditions de croissance, induction de gènes ou épuisement, comme l’AID7 (figure2 et figure complémentaire2), puis divisez la culture. Assurez-vous que tous les flacons et les supports sont à la température requise et, si possible, aérer le milieu avant d’ajouter la culture. Ajouter 4tU à la culture à une concentration de 10 mm m m et mélanger vigoureusement (1/10 000 du volume de culture de 100 mM 4tU dissous en 1 M NaOH). Étiquette Thiol de 15 s à 5 min.REMARQUE : Trente secondes est un bon point de départ. Thio-étiquetage pour moins de 20 s donne des résultats plus variables en raison de difficultés à manipuler la culture sous la pression du temps. Cependant, l’étiquetage pendant plus de 1 min réduit la résolution temporelle de la technique. Si une expérience de chasse doit être effectuée; permettre l’étiquetage thio pour 20 à 30 s puis chasser en ajoutant 1/200 volume de culture de 1 M d’uridine (non thioulé), à une concentration finale de 5 mM.REMARQUE: Uridine est préférable à l’uracil pour la chasse, comme l’uridine est plus soluble dans l’eau permettant un plus petit volume d’être ajouté à la culture et il ya donc moins de perturbation à la croissance des cellules. Prenez des échantillons de culture à intervalles réguliers (au moins 15 s), jusqu’à la fin du cours de temps. Il est difficile d’effectuer des intervalles d’échantillonnage plus courts que celui-ci. Ajouter l’échantillon au méthanol sur de la glace sèche préparée à l’étape 1.4. Pour plus de commodité, ajouter 30 ml de culture à un tube de 50 ml contenant 20 ml de méthanol.REMARQUE : Le dioxyde de carbone se dissout dans le méthanol lorsqu’il est froid; ceci sort de la solution sur l’addition de l’échantillon et mousse vigoureusement sur le mélange, résultant en la perte d’échantillon. Pour éviter cela, réfrigérer le méthanol à 70 oC dans un tube hermétiquement scellé jusqu’à ce qu’il soit près du moment nécessaire, puis transférer sur la glace sèche. Sceller le tube et bien mélanger en secouant. Placer les échantillons sur la glace. Vérifiez qu’aucun des échantillons n’a congelé; si c’est le cas, réchauffez doucement dans la main, en inversant constamment. C’est mieux fait dans la main que la température de l’échantillon peut être évaluée, il devrait toujours se sentir froid. Placer sur la glace. Ce n’est pas un point de pause; une fois que tout l’échantillon est fluide passer à l’étape suivante. Faire tourner à 3000 x g pendant 2 min (à 4 oC si possible) pour granuler les cellules. Verser le liquide et resuspendre la pastille dans au moins 1 ml d’eau glacée en faisant doucement monter et descendre.REMARQUE : Le méthanol résiduel dans l’échantillon aide à la résuspension. Transférer dans des tubes à capuchon à vis de 2 ml préparés à l’étape 1.4. Tourner brièvement (p. ex., 10 s temps total) à 13 000 x g pour re-pelleter les cellules, les remettre sur la glace et enlever le liquide.REMARQUE : Le granule cellulaire peut être stocké à -70 à -80 oC pendant plusieurs mois. 2. Préparation de l’ARN total REMARQUE: Le temps d’achèvement est de 90 min. Utilisez des solutions traitées au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) pour protéger l’ARN de la dégradation. Aliquot les solutions en utilisant des pointes de pipette filtre et porter des gants en tout temps. Pour une solution ajouter 1/1000 volume de DEPC et mélanger par secoussevigoureuse. Laisser à température ambiante (RT) pendant 24 h, puis autoclave. Les solutions avec les groupes d’amine (tels que les tris) ne peuvent pas être traitées par LE DEPC. Aliquot la poudre et stocker spécialement pour le travail de l’ARN. Utilisez précédemment DEPC traité H2O pour faire la solution.REMARQUE : Comme le thio-groupe sur l’ARN est photoactivatable, réduire au minimum l’exposition à la lumière UV à partir de ce point dessus. Le stockage doit être dans l’obscurité et l’incubation est préférable dans une machine PCR avec un couvercle. Si un pic de s. pombe doit être ajouté à la pastille cellulaire plutôt qu’à la culture (ne faites pas les deux), ajoutez-le maintenant. Décongeler un aliquot de cellules de S. pombe thiolated sur la glace et le vortex complètement, au moins 30 s, avant d’ajouter à la granule.REMARQUE : S’il est préparé selon les étapes 1.5.1-1.5.7, 10 ‘L de S. pombe aliquot est nécessaire pour une boulette dérivée de 30 ml de culture. Avant de mettre le bouchon, tourner très brièvement pendant 1/2 s pour s’assurer qu’aucune perle de zirconia n’est emprisonnée entre le capuchon et le tube, ce qui peut causer une fuite d’échantillon et de phénol du tube. Resuspendre les cellules dans 400 l de tampon EDTA (AE) en acétate (50 mM d’acétate de sodium pH 5,3, 10 mM EDTA pH 8,0), en vortexant vigoureusement. Ajouter 40 oL de 10 % (w/v) de sulfate de dodecyl de sodium (SDS). Ne pas vortex, comme SDS va mousser. Si le protocole AID 4U est à utiliser, prenez 40 ll de la suspension cellulaire pour l’analyse des protéines7. Ajouter 40 L d’AE pour faire remonter le volume jusqu’à 400 l. Ajouter 800 l de phénol (CAUTION) à faible pH et vortex pendant 10 s.CAUTION: Le phénol est toxique et corrosif par inhalation et contact. Effectuez toujours des procédures impliquant le phénol dans une hotte de fumée et portez deux paires de gants. Lyser les cellules dans un homogénéisateur (p. ex., Table of Materials) pendant trois rafales de 2 min au réglage de puissance le plus bas. Laisser les échantillons sur la glace pendant 2 min entre les impulsions d’homogénéisation.REMARQUE : Optimiser les conditions si vous utilisez d’autres homogénéisateurs. Des secousses insuffisantes entraîneront de faibles rendements, tandis que les secousses excessives entraîneront un rendement apparemment plus élevé, déterminé par l’absorption à 260 nm (A260), mais l’ARN peut être dégradé. Un homogénéisateur est préférable, mais la purification chaude d’ARN de phénol12 peut être employée. Placer l’échantillon lysé sur la glace sèche pendant 5 min, jusqu’à ce qu’il se solidifie, ce qui réduit l’ADN génomique reportdans dans l’ARN. Ne gèlez pas trop longtemps car l’échantillon ne dégèle pas. Spin 5 min en microfuge à 13 000 x g à RT; ne soyez pas tenté de le faire à 4 oC, car le mélange échantillon/phénol restera solide tout au long de la rotation s’il est effectué à basse température.REMARQUE : Si l’échantillon est encore congelé à la fin de la rotation, re-tourner pendant encore 5 min jusqu’à ce que l’échantillon ait complètement décongelé. Extrait de phénol/chloroforme puis extrait chloroforme avec un volume égal (environ 600 l) de phénol:chloroforme 5:1 puis chloroforme (CAUTION). Transférer la phase supérieure dans un autre tube contenant du phénol:chloroforme 5:1 ou chloroforme. Vortex, puis tourner pendant 5 min dans un microfuge à RT. Transférez ensuite la phase supérieure vers un nouveau tube de 1,5 ml.CAUTION: Le chloroforme est toxique par inhalation et contact. Effectuez toujours des procédures impliquant le chloroforme dans une hotte de fumée et portez deux paires de gants. Ajouter un troisième à un demi-volume (environ 300 l) de 10 M LiCl, et mélanger pour précipiter l’ARN. L’échantillon doit être nuageux immédiatement, mais laisser reposer au moins 10 min sur la glace ou à 4 oC (ne pas stocker en dessous de -20 oC car il gèle), ou jusqu’à ce que les flocculats précipités. Faites tourner pendant 5 min à 13 000 x g dans un microfuge. Retirez le liquide, faites-tourner brièvement et retirez les restes. Laver les granulés avec 300 à 500 l d’éthanol à 70 %, faire une rotation brève et retirer le reste de l’éthanol.REMARQUE: Pendant ces lavages garder la pastille sur le même côté du tube que la première vrille, de cette façon le granule ne se déplacera pas et se briser; s’il casse une partie de l’ARN pourrait être perdu accidentellement.REMARQUE : Ne pas sécher la pastille; tant que la majeure partie du liquide a été enlevée, il n’interfère pas avec les étapes suivantes. L’ARN peut également être stocké à ce stade à -20 oC pendant quelques mois ou de -70 à -80 oC pour le stockage à long terme. Re-dissoudre la pastille d’ARN dans 90 oL de PH TE 7,0 (10 mM Tris HCl pH 7,0, 1 mM EDTA pH 8,0) en chauffant à 65 oC avec secousses car le granule d’ARN peut être difficile à dissoudre. Cela ne doit pas être pour plus de 5 min que l’ARN se dégrade à des températures plus élevées. Vérifiez la solubilisation complète de l’ARN, puis transférez-vous dans un tube de 0,2 ml. Pipette l’échantillon de haut en bas; il ne devrait pas y avoir de « grumeaux », et le liquide devrait monter et tomber en douceur dans la pointe. Cette solution est visqueuse, de sorte que le mouvement final de pipetting doit être lent.REMARQUE : L’ARN peut être stocké à -20 oC dans l’obscurité à ce stade; cela peut également être bénéfique pour la solubilité de l’ARN. 3. Biotinylation REMARQUE: Le temps d’achèvement est de 60 min. Les étapes suivantes sont commodément faites dans une bande de tubes avec des bouchons intégrals car ils ont moins tendance à s’ouvrir sur le vortex que les bandes avec des bouchons séparés. Biotinylate en ajoutant 10L (1 /10 volume final) d’une solution HPDP-biotine de 5 mM (MTS-biotine peut être utilisé exactement de la même manière que HPDP-biotine), à l’ARN et mélanger soigneusement. Préchauffer l’ARN pendant au plus quelques secondes à 65 oC avant d’ajouter la biotine. Incuber à 65 oC pendant 15 min jusqu’à un maximum de 30 min dans l’obscurité.REMARQUE : Ce chauffage est nécessaire car certains lots de HPDP se précipitent à RT dans l’échantillon d’ARN. Un bloc PCR avec couvercle chauffé est idéal pour cela. Préparer un petit volume de résine, colonne d’exclusion de taille (Tableau des matériaux) pour exclure la biotine non incorporée. Retirez l’étiquette inférieure de la colonne et desserrez le bouchon, placez-le dans un tube de centrifugeuse de 2 ml. Tourner à 1500 x g pendant 1 min pour rincer le tampon Ajouter 0,3 ml de TE doucement vers le haut de la colonne et tourner à nouveau. Répétez le lavage et tournez deux fois de plus pour un total de 3 lavages. Enfin transférer la colonne lavée à un tube frais de 1,5 ml. Une fois l’incubation de l’échantillon (étape 3.1) terminée, ajoutez l’échantillon en haut de la colonne. Faire tourner à 1500 x g pendant 2 min. L’échantillon d’ARN biotinylated est maintenant dans le fond du tube.REMARQUE : Une rotation de 1 min n’est pas suffisante pour éliper l’échantillon entier. Ajouter un troisième à un demi-volume (environ 40 l) de 10 M LiCl, mélanger pour précipiter à nouveau l’ARN à l’étape 2.10. L’échantillon doit être nuageux immédiatement, mais laisser reposer au moins 5 min sur glace ou à 4 oC ou jusqu’à ce que les flocculagées précipitées se précipitent; ne pas stocker en dessous de -20 oC car il gèlera. Centrifugelifuger l’échantillon pendant 5 min à 13 000 x g dans un microfuge. Laver à 80 % d’éthanol, 1 h en rotation. Suivez la procédure à l’étape 2.11 pour enlever autant de liquide que possible.REMARQUE : Comme le HPDP-biotine est très soluble dans 80% d’éthanol, il s’agit d’une étape de purification supplémentaire. Répétez le lavage à 80 % d’éthanol pour enlever autant de biotine non incorporée que possible.REMARQUE : L’ARN peut également être stocké à ce stade à -20 oC dans l’obscurité. 4. Purification de l’ARN nouvellement synthétisé REMARQUE: Le temps d’achèvement est de 2 h. Re-dissoudre l’ARN dans 200 ‘L de DEPC-traité H2O (65 oC incubation peut être utilisé, semblable à la procédure à l’étape 2.12). Mesurer la concentration d’ARN à A260 à l’aide d’un spectrophotomètre; l’échantillon peut devoir être dilué 1/10 pour l’obtenir dans la plage linéaire du spectrophotomètre. Vortex cette dilution pendant au moins 10 s pour s’assurer que l’ARN visqueux est dissous uniformément.REMARQUE : L’efficacité de la biotinylation peut être évaluée par tache de point13 si nécessaire. Ajoutez des quantités égales d’ARN à un tube frais et faites jusqu’à 200 L dans H2O traité par DEPC. Utilisez tout l’échantillon avec la plus faible concentration d’ARN et utilisez un volume approprié des autres échantillons pour avoir une quantité similaire d’ARN pour chacun.REMARQUE: La feuille de calcul 4tU experiment template.xlsx a un formulaire pour faciliter ce calcul. Lorsque l’échantillon est à RT, ajouter 25 ‘L de 10 x NaTM tampon (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 ‘L de 1 M NaPi pH 6,8 (0,5 M NaH2PO4 0,5 M Na2HPO4) , et 2,5 L de 10 % de SDS. Bien mélanger et faire tourner délicatement (30 s; environ 100 x g).REMARQUE : Pour éviter les précipitations de la SDD et des sels, les échantillons doivent être conservés à RT tout au long des procédures suivantes jusqu’à l’étape 4.13. Faire le tampon de perle contenant 1x tampon NaTM, 0,1 M NaPi, et 0,1% SDS, 2 ml par échantillon. Ajouter la quantité requise de H2O d’abord et le SDS dernier. Cela doit être rendu frais à chaque fois comme un précipité forme après 24 h.REMARQUE : Pour éviter la formation de précipités, le tampon de perles doit être conservé à RT tout au long des procédures suivantes. Ne pas DEPC traiter ou autoclave. Ajouter 50 l de perles de streptavidin à un tube de faible rétention de 1,5 ml. Placez le tube sur le support magnétique, attendez que les perles se déposent, puis retirez le liquide Laver les perles de streptavidin. Ajouter 200 l de tampon de perles et de vortex jusqu’à ce que le granule de perle soit entièrement suspendu. Habituellement, 3-5 s est tout ce qui est nécessaire. Pour les lavages avant l’ajout de l’échantillon d’ARN, il suffit de tourner les tubes autour de sorte que les perles Voyage à travers le tube de l’autre côté. Puis retournez les tubes vers le côté d’origine afin que les perles voyagent à travers le tube une fois de plus. Faites tourner le tube à basse vitesse (environ 100 x g) pour un maximum de 5 s pour faire tourner le fluide, mais pas les perles. Placer dans le support magnétique pour permettre aux perles d’être capturées par l’aimant. Enlever le liquide par aspiration à un petit nombre d’échantillons; verser le liquide si de nombreux échantillons.REMARQUE : Avec un grand nombre d’échantillons, enlever tout le liquide purement par aspiration peut être problématique, car les perles dans le premier échantillon peuvent être séchées avant que le dernier échantillon soit fini, ceci augmente l’arrière-plan. Le lavage peut être accéléré en versant le liquide de tous les échantillons à la fois tandis que sur l’aimant. Ils doivent être laissés un peu plus longtemps sur l’aimant avant de verser et la petite quantité de liquide qui reste doit être aspiré, mais, dans l’ensemble, cela signifie moins de temps sur l’aimant et sans liquide. De cette façon, il est possible de faire 24 extractions ou plus rapidement. Bloquer avec un tampon de perles de 200 l, 10 x L 20 mg/mL de glycogène, et 2,5 x L 5 mg/mL de tRNA, 20 min d’extrémité rotative à une vitesse modérée à RT. La rotation est de garder les perles en suspension. Une fois le blocage terminé, retirez le liquide sous forme d’étapes 4.7.2-4.7.4 et lavez-les à nouveau, comme les étapes de la section 4.7. Resuspendre les perles dans l’échantillon. Incuber à RT avec rotation pendant 30 min. Pendant l’incubation, préparer un tube frais de 1,5 ml pour chaque échantillon. Ajouter 1/10 volume (environ 10 oL) de 3 M d’acétate de sodium pH 5,3 et 20 g de glycogène, et tourner à environ 100 x g pour 3 s. Conserver dans une grille jusqu’à ce que nécessaire. Retirez l’ARN non lié des perles, en tant qu’étapes 4.7.2-4.7.4. L’ARN non lié peut être persévéré dans un tube frais, mais les sels et les SDD le rendent très difficile à purifier. Ensuite, lavez les perles, comme section 4.7 avec le vortex, pour un minimum de 3 à un maximum de 5 fois. Après le lavage final prendre un soin particulier pour aspirer tout le liquide; retourner à chaque tube et aspirer les restes du tampon une fois de plus. Pour l’éliner, ajouter 50 l de 0,7 M d’éthanol fraîchement préparé (ME) aux perles(1/20 dilution de la solution de stock fournie commercialement). Vortex et tourner brièvement, comme étapes 4.7.1 et 4.7.2. Placez la boue dans le support magnétique et pipette la solution contenant l’ARN dans le tube de centrifugeuse de 1,5 ml préparé à l’étape 4.10. Elute une fois de plus comme étape 4.13 pour récupérer l’ARN résiduel des perles et ajouter l’échantillon éluté au tube contenant la première élution de ces perles. Retirez les perles résiduelles de l’ARN élucidé en replaçant l’échantillon dans le support magnétique et en transférant le liquide à un tube frais et faible de centrifugeuse de 0,5 mL. Mélanger l’échantillon, puis précipiter l’ARNsen en ajoutant 2,5 x volumes (280 l) d’éthanol et mélanger une fois de plus. Laisser reposer de 1 h à la nuit à -20 oC. Faire tourner dans une centrifugeuse préréfrigérée (4 oC) pendant 20 min à la vitesse maximale (au moins 13 000 x g). Laver soigneusement avec 200 l d’éthanol à 70 % d’éthanol à -20 oC. Étant donné que les résidus de l’ELM inhibent les applications en aval, tournez à chaque étape pour enlever autant de restes que possible; à la fin, l’échantillon ne doit pas sentir l’odeur de ME. Re-dissoudre dans 10 à 20 ‘L de 1x TE traité par DEPC avec l’équivalent de 0,005 ‘L inhibiteur de la RNase.REMARQUE : Toutes les étapes subséquentes doivent être effectuées sur la glace. Mesurer la concentration et la pureté de l’ARN. Mesurer l’A260 et l’A225 dans un spectrophotomètre à faible volume d’échantillon.REMARQUE : Un maximum d’absorption de près de 225 nm provient d’un contaminant inévitable provenant des perles. En l’absence d’ARN, le signal du contaminant diminue à 35 % à 260 nm. Par conséquent, la quantité réelle d’ARN est approximative par la formule : (A260-(A225’0.35))40 ng/l. Vous pouvez également analyser l’échantillon sur un système d’électrophores microfluidique tel qu’un bioanalyseur.REMARQUE : Cette analyse est préférable à l’utilisation d’un spectrophotomètre car l’intégrité de l’ARN peut être évaluée, le contaminant n’interfère pas avec la quantitation et moins d’échantillon est nécessaire. Analyser le nsRNA.REMARQUE : Par exemple, des ARN spécifiques peuvent être quantifiés par des techniques standard de transcriptase inverse qPCR. L’ARN préparé de cette façon est compatible avec la préparation de bibliothèque pour l’ARN-seq. L’enlèvement de l’ARNr n’est pas nécessaire pour les temps d’étiquetage de moins de 5 min. Le codage SLAMseq14 peut également être effectué sur cet ARN.

Representative Results

Les rendements typiques de l’ARNN récupéré à l’aide de ce protocole ers4tU sont affichés dans la figure 1b,ceci a été produit par un bioanalyseur et la trace montre le rendement de l’ARN par rapport à la taille (nucléotides [nt]). Notez, à la fois dans la trace bioanalyseur et le graphique enset, que la récupération de l’ARN à partir du point de temps 0 est une très petite partie de celle récupérée à partir de points de temps plus longs – environ 0,3 g d’ARN récupéré à partir d’environ 109 cellules par rapport à plus de deux fois plus après seulement 30 s d’étiquetage (0,8 g de nsARN) à partir du même nombre de cellules. La récupération de l’ARN à 15 s est plus variable car de petites différences dans l’exécution de l’échantillonnage ont un effet proportionnellement plus grand sur la récupération de l’ARN. Dans la trace de bioanalyseur, les précurseurs de l’ARNr peuvent être considérés comme un pic proche de 1000 nt et un doublet de pics à 1700-1800 nt. L’abondance de ces intermédiaires augmente à mesure que la thiolation se poursuit. Thio-étiquetage a été utilisé pour quantifier l’épissage de la transcription ACT1 (figure 3). La thiolation a été effectuée et des échantillons prélevés à intervalles de 15 s depuis le début du thio-étiquetage et le traitement de l’ARN ACT1 surveillés (Figure 3a,b). Comme on peut le voir, le pré-ARNm est généré (par transcription), et les lariats (par la première étape de l’épissage à partir de pré-ARNm), même après seulement 15 s d’étiquetage. Après environ 45 s à 1 min, les quantités de lariats et de pré-ARNm atteignent l’équilibre avec autant de ces espèces d’ARN étant créées par transcription que sont traitées loin par épissage. Pour produire les données indiquées dans la figure 3c, la souche a été pulsée avec 4tU pendant 25 s, puis chassée avec de l’uridine. La génération de pré-ARNm et de lariats atteint un maximum à 1 minute. Cela se compare bien à la figure 3b; le maximum atteint après 45 s pour atteindre l’équilibre plus les 25 s de l’étiquetage. Après le pic, les niveaux diminuent à mesure que les ARN étiquetés thio sont poursuivis à travers le processus d’épissage. La figure 3d montre l’épuisement d’un facteur d’épissage des protéines et son effet sur le métabolisme de l’ARN, à l’aide du système AID 4U6,7. Ici, Prp16p est réduit de niveaux physiologiques proches à 5% de ce niveau après 25 min d’épuisement. Prp16p est un facteur d’épissage essentiel pour la deuxième étape de l’épissage15. Les lariats sont enlevés au cours de la deuxième étape de l’épissage (Figure 3a), mais ici ils augmentent au-dessus du niveau de pré-ARNm que Prp16 devient limitant. Aux périodes d’épuisement plus tard, d’autres facteurs deviennent limitants en raison des effets secondaires, de sorte que les niveaux de diminution de lariat, et les niveaux de pré-arnas augmentent. Le niveau d’ARNm épissé diminue. Figure 1 : Croissance de la récupération de l’INM 4tU et de l’ARN. (a) 4-thiouracil affecte la croissance. L’augmentation de la concentration de 4tU dans le milieu de croissance de décrochage de YMM sans uracil augmente le temps de doublement de S. cerevisiae (BY4741) portant le plasmide p4Fui-PEST. La croissance de quatre cultures répliquées a été surveillée à 30 oC dans un Tecan Infinite Pro 200. Toutes les cultures étaient en phase de journal tout au long, avec OD600 entre 0,1 et 0,6. Mock est une culture de contrôle avec une quantité équivalente de NaOH ajouté, qui ne change pas en soi le taux de croissance. Ce graphique démontre que le thio-étiquetage est un compromis entre l’étiquetage rapide et les dommages à la cellule. Les barres d’erreur sont des erreurs standard de 4 répliques. (b) le rendement de l’ARNn augmente linéairement d’environ 15 s d’étiquetage. La figure principale montre les traces bio-analyseurs de purifié, nsRNA de 0 (non thiolé) à 2 min après l’ajout de 4tU à 15 s intervalles. Notez que l’échantillon de 15 s n’est pas montré, car il était indiscernable de l’échantillon non étiqueté. Les deux grands pics correspondent à des ARN ribosomal (RARN). Les précurseurs et les intermédiaires de l’ARNr sont visibles à mesure que plusieurs pics ont un poids moléculaire plus élevé que les RARN matures. La récupération de ces précurseurs et intermédiaires augmente avec le temps. Les résultats d’une expérience représentative sont présentés. Le graphique enset montre la récupération de nsRNA avec l’incubation croissante avec 4tU. Le rendement de nsRNA augmente avec l’augmentation du temps de croissance avec 4tU. La récupération est remarquablement linéaire (R2 – 0,934) tout au long de la durée de cette expérience et montre une légère augmentation sur le fond, même à 15 s étiquetage avec 4tU, même si elle n’est pas distinguable de l’échantillon non étiqueté à l’œil du bioanalyseur retrouver. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard pour trois répliques biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : protocole graphique AID 4U et est AID 4U. Un résumé graphique du protocole du protocole AID 4U. Le système de dégron inductible auxine (AID) qui, à son tour, épuise une protéine cible étiquetée AIDMD, se réfère à Barrass et al.7 pour un protocole détaillé. Dans ce cas, l’expression du système de dégron est initiée 25 min avant le début de la dégradation des protéines et la thiolation à chaque moment est de 1 min. Les échantillons sont prélevés avant l’induction et toutes les 2 minutes pendant l’épuisement. Une version animée apparaît dans la figure supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Précurseurs et intermédiaires de l’épissage de l’ARN ACT1. L’épissage des transcriptions pré-ARNm ACT1 a été surveillé par la transcription inverse quantitative PCR16. Les niveaux de précurseur d’ACT1 (pré-ARNm), de lariat-exon2 intermédiaire (Lariat) et de produit épissé (ARNM) sont montrés normalisés par rapport au niveau d’ACT1 Exon2 et aux niveaux d’état stables de ces ARN. (a) Emplacement des produits qPCR sur la transcription ACT1. Schéma des emplacements des produits qPCR utilisés pour évaluer les niveaux de précurseurs, intermédiaires et produits de la réaction épissage des transcriptions ACT1 16. Exons sont représentés par des boîtes, intron comme une ligne et les produits qPCR comme des lignes avec des diamants à chaque extrémité, la couleur correspond à ceux utilisés dans les graphiques. Le PCR pré-ARNm est spécifique pour pré-ARNm et non pas tous les intermédiaires de l’épissage que ce produit traverse le point de branche qui est perturbé après la première étape de l’épissage. Lariat PCR détectera le produit de la première étape de l’épissage et le lariat excisé produit après la seconde. L’ARNm PCR est spécifique pour le produit de l’épissage, l’ARNm. Les résultats de l’exon PCR (présent dans tous les précurseurs, intermédiaires et produits, à l’exception du lariat excisé) ne sont pas indiqués dans les graphiques car cela a été utilisé pour normaliser les données et est donc toujours égal à 1. (b) Thiolabelling continu. La quantité de pré-ARNm augmente avec le temps que 4tU est incorporé par transcription et, après un court délai, l’épissage convertit en lariat-exon2 produits intermédiaires et épissés. Les niveaux de ces espèces pré-ARNm et lariat sont détectables au-dessus de l’arrière-plan après aussi peu que 15 s de croissance avec 4tU et atteignent un maximum après environ 45 s d’étiquetage continu avec 4tU, à quel point leur production est équilibrée par la conversion à épissage l’ARNm et/ou la dégradation. Les valeurs sont normalisées à leur état stable (point le plus à gauche du graphique), et exon 2 niveaux pour montrer leur apparence et le traitement par rapport à la transcription de l’exon 2. Comme l’épissage de l’ARN d’ACT1 est en grande partie co-transcriptionnel4,17 ARNm épissé devient rapidement l’espèce la plus abondante, son niveau est similaire à celui de l’exon 2. Erreur standard de trois répliques biologiques, chacune a été admis en triple. (c) Pulse/chase. Pulsation de thiolation de 25 secondes suivie d’une poursuite avec uridine. Par rapport aux niveaux d’état stables de ces ARN (point le plus à gauche), ils sont initialement très abondants dans le pool nouvellement synthétisé. Les niveaux diminuent graduellement au fur et à mesure qu’ils sont transformés en ARNm (ou dégradés), ce qui se rapproche de niveaux très semblables aux niveaux d’état stables de 5 min. Erreur standard de trois répliques biologiques, chacune a été mise en état dans le triple. d) nsRNA et épuisement des protéines. Épissage des transcriptions pré-ARNM ACT1 surveillées par la transcription inverse quantitative PCR comme dans le panneau (a) lors de l’épuisement de la protéine Prp16 à l’aide du système de degron auxine tel que décrit dans la figure 2. Les niveaux de protéines Prp16 sont également affichés dans le graphique tracé par rapport au deuxième axe Y en pourcentage des niveaux antérieurs à l’épuisement des émadés. Prp16 est un composant vital de l’épiscédsome, particulièrement important pour la deuxième étape de l’épissage montré dans le panneau (a), après quoi les lariats sont dégradés. Lorsque cette étape devient limitante, les lariats s’accumulent initialement. Plus tard, les points d’épissage échouent complètement, les lariats ne sont plus produits et les niveaux de pré-ARNm augmentent. Les barres d’erreur sont l’erreur standard de trois répliques biologiques, chacune a été admis en triple. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Résumé graphique des sections de protocole 1 à 3. Les cellules sont thiolées avec 4tU et ont permis de se développer pour incorporer le nucléotide modifié dans l’ARN. Un pic de S. pombe thiolated peut être ajouté pour permettre la normalisation à travers les points de temps et les expériences. Le pouls du 4tU peut être chassé à l’aide d’uridine non thiolée. L’étiquetage peut être effectué en continu à partir de l’ajout de 4tU ou d’un changement aux conditions de croissance, la culture divisée et 4tU ajouté aux cultures à des moments croissants à partir du changement de condition de croissance, mais chaque étiquetage seulement pour une courte période. Les cellules sont recueillies, et l’ARN préparé à partir des cellules, de préférence à l’aide d’un homogénéisateur et des méthodes à base de phénol. L’ARN est biotinylated puis l’ARN biotinylated purifié de la biotine non incorporée utilisant une colonne d’exclusion de taille. Le nsRNA est maintenant prêt pour la purification avec des perles de streptavidin (section 4, Figure 5). Les nombres en rouge correspondent aux nombres d’étapes du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Résumé graphique de la section 4 du protocole. À la suite des sections 1 à 3 (figure4),les perles de streptavidin sont bloquées et l’échantillon d’ARN biotinylated ajouté aux perles préparées. L’ARN biotinylated se lie aux perles de streptavidin et à l’ARN non biotinylated enlevé et lavé. L’ARN biotinylated est éludé des perles à l’aide de ME et précipité prêt pour la recherche plus approfondie. Les nombres en rouge correspondent aux nombres d’étapes du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure supplémentaire 1 : Amélioration de la récupération de nsARN des cellules de levure avec et sans copies supplémentaires de l’importateur à 1 et 3 minutes de thio-étiquetage. Notez que Fui1 est le promoteur de la levure propre exprimé à partir d’un plasmide de 2 m. La copie génomique de ce gène est présente dans ces deux souches. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 2 : Version animée du protocole graphique AID 4U de l’AID 4U. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 1: 4tU-experiment-template.xltx. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.  Nom Plasmid Importateur/permease marqueur commentaire p4Fui S. cerevisiae Fui1 URA3 (URA3) Fui1 importe Uracil et Uridine, ce qui le rend idéal pour les expériences pulse/chase. pAT2 (en) S. cerevisiae Fui1 LEU2 (En) p4Fui-PEST S. cerevisiae Fui1 URA3 (URA3) Le motif PEST de Fui1 a été désactivé, de sorte que la permease n’est pas dégradée lorsqu’il y a suffisamment d’uracil intracellulaire pour les besoins de la cellule. Fonctionne bien dans les expériences d’étiquetage et améliore les performances de pouls/chasse. p4Fourrure S. cerevisiae Fur4 URA3 (URA3) Ouracil permease YEpEBI311 (yepEBI311) H. Sapiens ENT1 LEU2 (En) Miller et coll.11. Contient également un gène HSV thymidine kinase. (transporteur nucléoside équilibrat) Tous les plasmides sont de 2 m à base. Tous les plasmides p4 et pAT sont basés sur la série pRS16 de plasmides. FUI1 et FUR4 sont exprimés à partir de leurs propres promoteurs endogènes. Tableau 1 : Plasmides utilisés avec ce protocole.

Discussion

Cet article présente un protocole pour l’étiquetage 4tU extrêmement rapide et spécifique, pour la récupération de l’ARN naissant et nouvellement synthétisé de S. cerevisiae après aussi peu que 15 s d’étiquetage, avec la contamination très faible par l’ARN non étiqueté.

L’utilisateur doit toujours prendre soin de maintenir l’intégrité de l’ARN par l’utilisation de températures froides et de réactifs traités par LE DEPC. La purification de perle de Streptavidin est généralement fiable ; cependant, le tampon de perles est difficile à manipuler; il doit être fait fraîchement, avec ses composants ajoutés dans le bon ordre, et non réfrigéré ou autoclaved. Les défaillances courantes comprennent l’ARN étant incomplètement dissous après les étapes de précipitation, et donc n’étant pas biotinylated ou autrement perdu pendant les étapes de traitement. Il y a une aide importante de dépannage dans le matériel supplémentaire.

Il y a quelques limites à connaître dans ers4tU. Un déjà mentionné est que 4tU ralentit la croissance de la levure (Figure 1a). En dehors des ARN endogènement thiolés9, seuls les ARN qui ont été transcrits pendant la période d’étiquetage peuvent être purifiés par cette méthode. Les polymères en pause sur les gènes tout au long du temps de thiolation ne produiront pas de transcriptions thiolées qui peuvent être purifiées, bien que les transcriptions qui sont partiellement étiquetées en raison de polymères entrant ou sortant d’un état de pause pendant la thiolation peuvent être récupérées. Les souches qui transcrivent mal, soit en raison de mutations ou de conditions de croissance, produisent peu de nsARN, bien que les techniques utilisées ici permettra néanmoins d’améliorer la récupération de l’ARNN par rapport à d’autres méthodes. Des temps plus longs et des volumes de culture accrus peuvent être nécessaires dans ces souches et conditions. Notez que l’uracil est une bonne source d’azote et donc cette méthode doit être testé avant d’être utilisé pour des études impliquant la famine d’azote.

Le protocole ers4tU est particulièrement utile pour l’analyse des ARN de courte durée, dont beaucoup sont si rapidement dégradés qu’ils ne peuvent pas être identifiés sans paralyser la machinerie de dégradation. Les exemples incluent les transcriptions instables cryptiques (CUTs)4, et les transcriptions courtes produites par la terminaison prématurée ou la rupture proximale de promoteur18 et la transcription antisens « en amont » d’un promoteur (PROMPTs)19. Les intermédiaires produits lors du traitement des espèces d’ARN stables sont également transitoires mais peuvent être enrichis à l’aide de la transcription ers4tU4. Le protocole ers4tU est donc exceptionnel en permettant l’analyse et la capture d’espèces d’ARN très transitoires dans des conditions physiologiques proches, ce qui est un énorme avantage par rapport aux autres méthodes. Cette technique a été utilisée pour étudier la transcription et la cinétique de traitement de l’ARN en aval chez les mutants de polymérase d’ARN qui s’allongent plus rapidement ou plus lentement que la normale20.

La thiolation est également compatible avec L’ARN-seq et SLAM-seq21, permettant à tous les ARN produits dans une fenêtre de temps très courte d’être caractérisés dans le détail exquis.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le financement de Wellcome à JB [104648]. Les travaux du Wellcome Centre for Cell Biology sont appuyés par le financement de base de Wellcome [092076]. Les auteurs reconnaissent les membres du laboratoire pour leur aide : Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna De Lucas-Arias et Shiney George. Les auteurs souhaitent également remercier Patrick Cramer pour le plasmien YEpEBI31111.

Materials

β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332
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Referencias

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4-ThiouracilRNA LabelingIn VivoPulse-chase ExperimentsProtein DepletionThiolationYeastS. PombeMetabolic LabelingRNA ExtractionAE BufferPhenol Extraction

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Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).
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