极快速和特殊的代谢标签的RNA在Vivo与4-Thiouracil （Ers4tU）
Summary
使用硫化尿素来敏感和专门地从酵母糖母体中纯化新转录的RNA。
Abstract
核苷酸类似物，4-thiouracil（4tU），很容易被细胞吸收，并结合到RNA中，因为它在体内转录，允许分离产生的RNA在短暂的标签。这是通过使用链球菌膜涂层珠子，通过将生物链球菌附着到合并的硫组和亲和纯化上来实现的。实现纯、新合成的RNA的良好产量，不含先前存在的RNA，从而缩短标签时间，并允许在动力学研究中提高时间分辨率。这是一种用于新合成RNA非常特异性、高产纯化的协议。这里介绍的协议描述了RNA是如何从酵母糖精中提取的。然而，从总RNA中纯化硫化RNA的协议应该有效地使用从任何生物体中的RNA，一旦从细胞中提取。纯化RNA适用于许多广泛使用的技术进行分析，如逆转录酶-qPCR、RNA-seq和SLAM-seq。该技术的特异性、敏感性和灵活性使人们对RNA代谢具有无与伦比的洞察力。
Introduction
RNA具有动态性;产生后不久，许多RNA被迅速处理和降解。目前，大多数RNA代谢研究分析总细胞RNA，这是大部分完全处理和稳定状态水平。此水平取决于转录率、转录后成熟和降解之间的平衡。分析导致稳定状态平衡的过程需要专门技术来捕获寿命极短的RNA物种。
RNA与核苷酸类似物（如4硫尿酸（4tU）或4硫尿碱（4sU）的代谢标签（见Duffy等人1，用于极好的审查），提供分离Thio标签新生RNA及其加工中间体的能力。然而，公布的协议涉及几分钟2，3的标签时间，相对于许多成绩单的制作速度而言，这是缓慢的。转录平均酵母基因大约需要一分钟，因此将酵母RNA标记不到一分钟可视为极短。极快速和特定的4thiouracil协议（ers4tU）通过最大化4tU的加入和最小化未标记的、预先存在的RNA的恢复，使极短的标记时间成为可能4。因此，信号与噪声比最大化。
硫修饰碱基必须快速、足够数量地导入细胞，以有效标记新合成的RNA（nsRNA）。为了促进这一点，细胞生长在无尿毒的培养基中，适当的渗透酶的表达有助于促进4tU或4sU的接受（参见表1，了解携带适当渗透基因的质粒列表和补充图1）。4tU 在氢氧化钠中的溶解度避免了其他核苷酸类似物所需的有毒有机溶剂。不幸的是，长期生长的培养物与硫改性核苷浓度大于50μM已被观察到破坏核糖体5。然而，这里使用的浓度（10μM），以及极短的贴标时间，最大限度地减少有害影响5（图1a），同时仍产生足够的RNA进行分析。
该技术可以结合快速和特定的辅助蛋白介导耗尽靶蛋白6，7（图2），称为”β-est AID 4U”协议，其中β-雌二醇调节表达的辅助蛋白诱导脱粒 （AID） 系统与 4tU 标签相结合。使用β-est AID 4U方法，目标蛋白可以耗尽，并密切监测对RNA代谢的影响（图2）。时机至关重要;建议查看随附的视频并密切关注图 2及其动画形式（参见补充图 2）。
为了准确的时间分辨率，必须极快地停止RNA的加工和降解。这是在低温下使用甲醇实现的，它非常迅速地修复细胞内容，降低细胞膜的降解，同时保留核酸含量8。RNA提取应有效，不会损害RNA。在无超效剂的情况下，机械性莱沙是有效的（通常这些物质群含有硫类，因此应避免）。RNA的氯化锂沉淀是首选，因为tRNA的沉淀效率较低。tRNA被快速转录和自然硫化9，因此去除tRNA减少了生物异化试剂的竞争。如果对小型、高度结构化的RNA感兴趣，建议采用基于酒精的RNA沉淀方法。
为了恢复硫化RNA，生物锡通过与4tU结合在RNA中的硫组共价附着。建议使用改性生物素，该生物素通过可夹层二硫化物键（例如，HPDP-生物素（N-[6-（生物酰胺）h exyl]-3-（2 ° – yridyldithio）propion酰胺）或 MTS-生物素（甲硫素））进行附加使用因为它允许通过添加还原剂释放RNA。生物小化RNA在链球菌中与磁珠结合的亲和纯化。此协议与前面列出的其他协议10类似，但已经过密集优化以减少背景。
有两种类型的二醇标签实验可以执行，连续和不连续标签。每一个都有自己的优势。在连续贴标中，4tU 被添加到定期采集的培养和样品中。这种类型的实验显示了RNA的处理方式以及水平如何随时间而变化。示例包括突变体与野生型实验的比较和脉冲追逐实验。图3b，c所示的实验是这种类型的。对于不连续的标签，系统会引起变化，RNA被监测。一旦引起变化，文化必须分裂成几个子文化，在特定的时间，每个文化然后被标记很短的时间。一个例子是 #-est AID 4U，如图27所示。这种类型的实验对于监测代谢变化对RNA处理的影响特别有用（见图3d）。
图 4和图5中提供了 Thio 标签实验的图形表示形式，并且提供了一个大大简化协议性能的电子表格（请参阅4tU 实验模板.xlsx）。此外，补充信息还包含广泛的故障排除指南。有关将 4tU 标签与辅助耗尽协议集成的 *-est AID 4U 协议，参见图 2和补充图 2。关于详细的AID消耗协议，见Barras等人7。
Protocol
1. 生长和硫贴标签 注： 完成协议这一部分的时间是高度可变的，具体取决于细胞生长速率。在贴标签前留出 1 小时准备溶液和设备，并在标签后 30 分钟进行加工样品。 确保S.cerevisiae菌株含有一种质粒编码的permease（表1），以增强4tU导入细胞。注：如果没有进口商，标签少于2分钟不太可能成功11（参见补充图1）。4tU 合并是更有效的，如果生长是在中等没有 uracil，所以应变必须是URA3+;表1中的几个质粒携带URA3作为标记。如果此协议要与 β-est AID 损耗7结合，则需要进行额外的应变修改。 通过在1 L水中加入6.9克不含氨基酸的酵母氮碱、20克葡萄糖和1.92克SCSM单滴出-ura（材料表），制备无YMM尿素培养基。高压灭菌或过滤器在使用前对生长培养基进行灭菌。注： 过滤灭菌是首选的肽/糖复合物，通过高压灭菌与样品收集中使用的甲醇中的细胞共沉淀产生。 在YMM无尿素介质中生长酵母，在600nm（OD600）为0.6~0.8时，将酵母生长到光学密度。确保文化处于日志阶段增长，并且至少已经翻了两倍。通常建议在30°C下生长，但可以使用其他温度，例如，温度敏感菌株。注：根据菌株、生长条件和RNA产量，需要大约30 mL样品量。此金额将在整个协议中假定。30 mL 的培养剂是最适合在 50 mL 的离心管中，具有 20 mL 的甲醇，因此是开始优化的方便体积。考虑在早期点使用更多的样本量来增加RNA的恢复，高达2000 mL用于在真正短的标记时间（<1分钟）缓慢生长的细胞。 在冰上冷却约 50 mL 的 H2O。对于每个样品，将 200 μL 的氧化铝珠加入 2 mL 螺钉盖管中，在冰上冷却。还将 20 mL 甲醇（警告）放入 50 mL 离心管中，并放置在干冰上（警告）。甲醇的体积应为样品的1/3至2/3。注意：甲醇因吸入、接触和食用而有毒。在烟罩中大量分配，并戴上两副手套，因为甲醇可以穿透硝化实验室手套。甲醇是高度易燃的，远离所有点火源。注意：由于干冰在接触时会导致冷灼伤，并产生硫气气体，因此在通风良好的空间内操作和使用时，请使用手套。注：此时添加珠子比添加样品后更容易，因为管是干燥的，当向下旋转细胞颗粒时，珠子也会从管螺纹上旋转，从而节省一些时间。此外，这允许珠子在添加样品之前冷却。 如果要将S. pombe尖峰添加到培养物中（而不是稍后），则彻底解冻冰上和涡旋上的硫化S. pombe细胞的等分，至少 30 s，然后添加到培养物中。如果按照以下说明进行准备，一个S. pombe等分就足以用于 400 mL 的培养值（足够 12 个 30 mL 样品加上一点允许处理错误）。如果使用或多或少的区域性，请调整添加到区域性的S. pombe的音量。 生长 1 L 的S. pombe培养到 OD600到 0.8 完全如S. cerevisae协议中所述。 Thio 标签作为步骤 1.7，但为 10 分钟。 使用 400 mL 的甲醇在干冰上修复所有培养物，基本上如步骤 1.9 中所述。 在3000 x g下通过离心将细胞进行3分钟的离心。 丢弃上清液，在H2O的3.3 mL中重新悬浮细胞颗粒。 分裂成各80 μL的等分。储存在-80°C。 对于 400 mL 培养法或每 30 mL 样品使用 10 μL 的所有等分。注：如果执行RNAseq，则将尖峰的音量减小到1/10。不要重复使用等分;丢弃任何未使用的尖峰。此峰值可用于跨时间点和实验对结果进行规范化和比较。 对于不连续的标签，诱导所需的代谢扰动（例如，生长条件、基因诱导或消耗，如β-est AID7（图2和补充图2），然后分裂培养。确保所有烧瓶和介质处于所需温度，如果可能，在添加培养物之前对介质进行加空。 将 4tU 添加到浓度为 10 μmM 的培养体中，并大力混合（100 mM 4tU 的培养体积的1/10，000溶解在 1 M NaOH 中）。15 s 至 5 分钟。注：30秒是一个很好的起点。不到 20 s 的 Thio 标签会产生更多可变的结果，因为难以在时间压力下操纵培养物。然而，标签超过1分钟会降低该技术的时间分辨率。 如果要进行追逐实验;如果要进行追逐实验，则进行追逐实验。允许硫贴20-30s，然后通过添加1 / 200培养体积1M尿氨酸（不硫化），到5 mM的最终浓度追逐。注：尿氨酸比尿毒器更可取，因为尿氨酸是水溶性更大的，允许向培养中添加更小的体积，因此对细胞生长的干扰较小。 定期采集文化样本（至少 15 秒），到时间课程结束。比这更短的采样间隔很难可靠地执行。将样品添加到步骤 1.4 中准备的干冰上甲醇中。为方便起见，在含有 20 mL 甲醇的 50 mL 管中加入 30 mL 培养剂。注：二氧化碳在冷时溶解在甲醇中;当添加样品和混合时大力添加泡沫时，溶液就会产生，从而导致样品损失。为了避免这种情况，将甲醇冷却至<-70°C，在密封的管中，直到接近需要的时间，然后转移到干冰中。 密封管，通过摇动彻底混合。将样品放在冰上。检查没有样品已冻结;如果是这样，轻轻地温暖在手，不断反转。这是最好的做手，因为样品的温度可以评估，它应该总是感到寒冷。放在冰上。这不是暂停点;一旦所有样品都流动，继续下一步。 以 3000 x g旋转 2 分钟（如果可能为 4°C），以颗粒细胞。通过上下轻轻移液，将液体倒入至少 1 mL 的冰冷的水中。注：样品颗粒中的残留甲醇有助于重新悬浮。 如步骤 1.4 中准备的那样转移到 2 mL 螺钉盖管。以 >13，000 x g的时间短暂旋转（例如，总时间 10 s），以重新颗粒细胞，放回冰上并去除液体。注：细胞颗粒可在-70至-80°C下储存数月。 2. 总RNA的制备 注：完成时间为 90 分钟。 使用二乙酰热盐 （DEPC） 处理的解决方案保护 RNA 免受降解。使用过滤移液器吸头对溶液进行贴切，并随时戴上手套。 在溶液中加入1/1000体积的DEPC，通过剧烈的晃动混合。 在室温 （RT） 下离开 24 小时，然后高压灭菌器。 胺组（如三组）的解决方案不能进行DEPC处理。将粉末与储存的粉末并专门储存，用于RNA工作。使用先前经过 DEPC 处理的 H2O 来制造溶液。注：由于RNA上的硫组是可光激活的，因此从此时起尽量减少紫外线照射。储存应在黑暗中，孵育最好在带盖子的PCR机中进行。 如果要将S. pombe尖峰添加到细胞颗粒中，而不是将培养点（不要同时执行），则立即添加。在加入颗粒之前，在冰和涡旋处彻底解冻硫化S.pombe细胞的等分。注：如果根据步骤1.5.1~1.5.7制备，从30 mL培养的一粒颗粒中衍生出一粒颗粒需要10μL的S.pombe等分。 戴上盖子之前，先简单旋转 1⁄2 s，以确保盖和管之间没有捕获任何氧化硅珠，这可能导致样品和苯酚从管中泄漏。 通过大力涡旋，在400 μL的醋酸EDTA（AE）缓冲液（50mM醋酸钠pH 5.3，10mM EDTA pH 8.0）中重新悬浮细胞。加入40 μL 10%（w/v）硫酸钠（SDS）。不要涡旋，因为SDS会发泡。 如果使用β-est AID 4U协议，取取40μL的细胞悬浮液进行蛋白质分析7。加入 40 μL 的 AE，使音量回升至 400 μL。 在低pH值和涡旋下加入800μL的苯酚（警告），10s。注意：苯酚因吸入和接触而有毒和具有腐蚀性。始终在烟罩中执行涉及苯酚的程序，并戴上两副手套。 在均质器（例如，材料表）中使细胞在最低功率设置下连续三次2分钟。在均质脉冲之间将样品留在冰上 2 分钟。注：如果使用其他均质器，则优化条件。抖动不足会导致产量低，而过度晃动会导致明显的更高产量，如260nm（A260）的吸收率所决定的，但RNA可能会降解。首选均质器，但可以使用热酚RNA纯化12。 将分丝样品放在干冰上5分钟，直到它凝固，这减少了基因组DNA携带到RNA。当样品不会解冻时，不要冻结太久。在 RT 时，在 >13，000 x g处旋转 5 分钟微fuge;不要想在4°C下这样做，因为样品/苯酚混合物在低温下进行，在整个旋转过程中将保持固体。注：如果样品在旋转结束时仍冻结，则再旋转 5 分钟，直到样品完全解冻。 苯酚/氯仿提取物，然后氯仿提取物与相同体积（约600μL）的苯酚：氯仿5：1，然后氯仿（警告）。将顶相转移到另一个含有苯酚的管：氯仿5：1或氯仿。涡旋，然后在RT的微熔中旋转5分钟。然后，将顶相转移到新的 1.5 mL 管中。注意：氯仿因吸入和接触而有毒。始终在烟罩中执行涉及氯仿的程序，并戴上两副手套。 加入三分之一至一半体积（约300μL）的10M LiCl，并混合沉淀RNA。样品应立即变浑浊，但在冰上或4°C（不要储存在-20°C以下，因为会结冰）或直到沉淀浮冰之前至少离开10分钟。 在微熔中旋转 5 分钟，速度为 >13，000 x g。取出液体，短暂重新旋转并清除渣子。用 300~500 μL 的 70% 乙醇清洗颗粒，短暂旋转并去除剩余的乙醇。注：在这些打用过程中，将颗粒与第一次旋转放在管的同一侧，这样颗粒就不会移动和折断;如果它打破了一些RNA可能会意外丢失。注：请勿干燥颗粒;只要大部分液体已去除，就不会干扰后续步骤。RNA也可在此阶段在-20°C储存数月或-70至-80°C长期储存。 在 TE pH 7.0 （10 mM Tris HCl pH 7.0， 1 mM EDTA pH 8.0） 中重新溶解 90 μL 中的 RNA 颗粒，在 65°C 下加热，摇动，因为 RNA 颗粒可能难以重新溶解。这必须不超过5分钟，因为RNA在较高温度下降解。检查完整的RNA溶解，然后转移到0.2 mL管。上下移液样品;不应该有”块状”，流体应该上升和下降顺利在尖端。此溶液粘稠，因此最终移液运动应缓慢。注：RNA可在此阶段在黑暗中储存在-20°C;这也有益于RNA的溶解度。 3. 生物异化 注：完成时间为 60 分钟。以下步骤在带积分盖的管条中方便完成，因为它们与具有单独盖的带相比，在涡旋时打开的倾向要小。 通过在RNA中加入10μL（1/10最终体积）的5mM HPDP-生物锡溶液（MTS-生物锡，可与HPDP-生物锡一模一样）在RNA中充分混合。在加入生物素之前，在65°C下预热RNA不超过几秒钟。在黑暗中在65°C孵育15分钟至最多30分钟。注：由于RNA样品中某些HPDP批次沉淀在RT上，因此需要这种加热。带加热盖的 PCR 块是理想的选择。 准备小树脂体积，大小排除柱 （材料表） 以排除未合并的生物锡。拆下柱的底部标签并松开盖，放入 2 mL 离心管中。以 1500 x g旋转 1 分钟以冲洗缓冲液 将 0.3 mL 的 TE 轻轻添加到柱的顶部，然后再次旋转。重复洗涤，再旋转两次，共洗3次。最后将洗涤柱转移到新鲜的 1.5 mL 管中。 样品孵育完成后（步骤 3.1），将样本添加到列的顶部。以 1500 x g旋转2 分钟。生物酸酯RNA样品现在在管的底部。注： 1 分钟的旋转不足以使整个样本洗取。 加入三分之一至一半体积（约40μL）的10M LiCl，混合以重新沉淀RNA作为步骤2.10。样品应立即变浑浊，但在冰上或4°C或沉淀浮游之前至少留5分钟;不要储存在-20°C以下，因为它会冻结。在微熔中，在 >13，000 x g处将样品离心 5 分钟。 用80%乙醇清洗，旋转±1小时。按照步骤 2.11 中的步骤清除尽可能多的液体。注：由于HPDP-生物锡在80%乙醇中非常可溶性，这是一个额外的纯化步骤。 重复80%乙醇洗涤，以去除尽可能多的未加入的生物锡。注：RNA也可以储存在此阶段在-20°C在黑暗中。 4. 新合成RNA的纯化 注：完成时间为 2 小时。 在200 μL的DEPC处理的H2 O（65°C孵育可用于使用，类似于步骤2.12中的程序）中重新溶解RNA。 使用分光光度计测量A260的RNA浓度;样品可能需要稀释1/10才能在分光光度计的线性范围内。涡旋这种稀释至少10s，以确保粘性RNA均匀溶解。注：如果需要，可以通过点斑点13来评估生物异化的效率。 在DEPC处理的H2 O中加入同等量的RNA，并组成高达200μL。使用所有RNA浓度最低的样品，并使用其他样品的适当体积，为每个样品提供同样数量的RNA。注：电子表格4tU 实验模板.xlsx具有有助于此计算的表单。 当样品在RT时，添加25 μL的10 x NaTM缓冲液（0.1M Tris HCl pH 7.0，2M NaCl，250 mM MgCl 2），25 μL 的 1 M NaPi pH 6.8 （0.5 M NaH2PO4 0.5 M Na2HPO4），和 2.5 μL 的 10% SDS。彻底混合，轻轻旋转（<30 s;约100 x g）。注：为了避免SDS和盐的沉淀，在步骤4.13的以下过程中，样品必须保存在RT。 使珠子缓冲液包含 1x NaTM 缓冲液、0.1 M NaPi 和 0.1% SDS，每个样品 2 mL。先添加 H2O 的所需量，最后添加 SDS。每次在 24 小时后，都必须以沉淀形式制作新鲜。注：为了避免沉淀物的形成，在以下过程中，必须将珠子缓冲液保持在RT处。请勿进行 DEPC 治疗或高压灭菌。 将50 μL的链球菌珠加入低保留管1.5 mL管中。将管子放在磁性机架上，等待珠子沉淀，然后取出液体 清洗链球菌珠。 加入200 μL的珠缓冲液和涡流，直到珠子颗粒完全重新悬浮。通常3~5s是所有需要的。在添加RNA样品之前进行轮化，将管子转动就足够了，这样珠子就会穿过管子到达另一侧。然后转动管回到原来的一侧，使珠子再次穿过管。 低速旋转管（约 100 x g），最多 5 s 以旋转流体，但不包括珠子。 放置在磁性机架中，以便磁体捕获磁珠。 通过吸入少量样品来清除液体;如果样品很多，就倒掉液体。注：对于大量样品，完全通过吸入去除所有液体可能会有问题，因为第一个样品中的珠子可能在最后一个样品完成之前燥，这增加了背景。在磁铁上一次从所有样品中倒出液体，可以加快清洗速度。在浇注之前，它们应该在磁体上停留一段时间，剩下的少量液体必须吸气，但总体而言，这意味着在磁体上的时间更少，没有液体。通过这种方式，可以快速进行 24 次或更多次提取。 块与200μL珠缓冲液，10μL 20毫克/mL糖原，和2.5μL 5毫克/mL tRNA，20分钟旋转结束在RT中等速度。旋转是保持珠子悬浮。阻塞完成后，按步骤 4.7.2_4.7.4 取出液体，然后再次清洗，如第 4.7 节中的步骤。 重新悬浮样品中的珠子。在 RT 孵育，旋转 30 分钟。 在孵育期间，为每个样品准备一个新鲜的1.5 mL管。加入1/10体积（约10 μL）的3M醋酸钠pH 5.3和20μg的糖原，并在约100 x g旋转3s，储存在机架中，直到需要为止。 如步骤 4.7.2_4.7.4 从珠子中取出未结合的 RNA。未结合的RNA可以在新鲜的管中坚持，但盐和SDS使得它很难被纯化。然后用涡旋将珠子洗至4.7节，至少3至5次。 最后洗涤后特别注意吸出所有的液体;返回到每个管，并再次吸出缓冲液的渣。 要使RNA脱脂，在珠子中加入50μL的新鲜制备的0.7M β-甲酸醇（βME）（商业供应的库存溶液稀释1/20）。涡旋和旋转短暂，如步骤 4.7.1 和 4.7.2。将浆料放入磁性机架中，将含有RNA的溶液移液至步骤4.10中制备的1.5 mL离心管中。 再次作为步骤 4.13 从珠子中回收残留的RNA，并将洗脱的样品添加到含有这些珠子中第一个洗脱的管中。 将样品放回磁架中，并将液体转移到新鲜、低结合的 0.5 mL 离心管中，从洗脱的 RNA 中去除残留的珠子。 混合样品，然后加入2.5x体积（280μL）乙醇，然后沉淀nsRNA，并再次混合。在 -20 °C 下离开 1 小时至过夜。在预冷却离心机（4 °C）中以最大速度旋转20分钟（至少13，000 x g）。 在-20°C下用200μL的70%乙醇彻底清洗。由于残余μME将抑制下游应用，每一步旋转以尽可能多地去除渣;最后，样品不应闻到βME的气味。 在10~20μL的DEPC处理1x TE中重新溶解，当量为0.005μL RNase抑制剂。注： 所有后续阶段应在冰上执行。 测量RNA浓度和纯度。 在低采样体积分光光度计中测量 A260和 A225。注： 接近 ± = 225 nm 的吸收最大值来自珠子中不可避免的污染物。在没有RNA的情况下，污染物的信号在+=260nm时下降到35%。因此，RNA的实际量由公式近似：（A260-（A225±0.35）*40纳克/μL。 或者，分析微流体电泳系统（如生物分析仪）上的样品。注：此分析优于使用分光光度计，因为可以评估 RNA 完整性，污染物不会干扰定量，所需样品更少。 分析nsRNA。注：例如，特定的RNA可以通过标准逆转录酶qPCR技术进行量化。以这种方式制备的RNA与RNA-seq的库制备相容。去除rRNA对于标签时间少于5分钟是不必要的。对SLAMseq14进行重新编码也可以对该RNA进行编码。
Representative Results
使用这个ers4tU协议恢复的nsRNA的典型产量如图1b所示，这已由生物分析仪产生，并且微量显示RNA与大小（核苷酸[nt]）的产量。请注意，在生物分析仪跟踪和示波图中，RNA从时间点 0 的恢复只是从较长时间点恢复的很小的一部分 – 大约 0.3 μg 的 RNA 从大约 109个细胞中恢复，而超过两倍从相同数量的细胞中贴上30s的标签（0.8 μg nsRNA）。15s的RNA恢复是可变的，因为执行采样的微小差异对RNA恢复有相应的较大影响。在生物分析仪追踪中，rRNA前体可被视为接近1000 nt的峰值和1700~1800 nt的峰值的双峰。随着硫化的继续，这些中间体的丰度也会增加。 Thio 标签用于量化ACT1成绩单的拼接（图3）。从检测的ACT1RNA开始和ACT1RNA的处理开始，每隔15秒进行硫化和取样（图3a，b）。可以看出，前mRNA产生（通过转录），和幼虫（通过从mRNA前拼接的第一步），即使仅仅经过15s的标签。大约45秒到1分钟后，幼虫和mRNA前的数量达到平衡，这些RNA物种中通过转录产生的RNA种类和通过拼接处理的RNA物种数量一样多。 为了生成图3c所示的数据，用4tU脉冲应变25秒，然后用尿氨酸进行追逐。前mRNA和幼虫的生成在1分钟内达到最大值。这与图3b相比，情况良好。45s 后达到平衡的最大值加上标签的 25 s。峰值后，随着硫标记RNA在拼接过程中被追逐，水平会下降。 图3d显示了蛋白质拼接因子的消耗及其对RNA代谢的影响，使用β-est AID 4U系统6，7。在这里，Prp16p在25分钟的耗竭后从接近生理水平减少到该水平的5%。Prp16p 是拼接15的第二步的基本拼接因子。在拼接的第二步（图3a）中去除拉里亚特，但在这里，随着Prp16成为限制，它们会超过mRNA前的水平。在后来的耗竭时间，其他因素由于二次效应而受到限制，因此幼虫水平下降，mRNA前水平升高。拼接 mRNA 的水平下降。 图1：4tU和RNA恢复的增长。（a） 4-锡拉西尔影响生长.增加4tU在YMM滴出生长培养基的浓度没有uracil增加S.cerevisae（BY4741）携带p4Fui_PEST质粒的倍增时间。 在 Tecan 无限 Pro 200 中，在 30°C 下监测了四种复制培养物的生长。所有区域性始终处于对数阶段，OD600介于 0.1 和 0.6 之间。模拟是添加等效数量的 NaOH 的控制区域性，这本身不会改变增长率。该图表明，硫标签是快速贴标和细胞损伤之间的折衷。错误条形是 4 次复制的标准错误。（b） nsRNA的产量从大约15s的标签线性增加。主要图显示了在15秒间隔添加4tU后，纯化nsRNA的生物分析仪痕迹从0（非硫化）到2分钟。请注意，15 s 样本未显示，因为它与未标记的样本无法区分。两个大峰对应于核糖体RNA（rRNA）。rRNA前体和中间体在分子量大于成熟rRNA时可见几个峰。这些前体和中间体的回收随着时间的推移而增加。显示了一个代表性实验的结果。内联图显示了nsRNA的恢复，4tU的孵育增加。nsRNA 的产量随着 4tU 的生长时间的增加而增加。在整个实验的整个时间尺度上，恢复非常线性（R2 = 0.934），即使在 15 s 贴标时，即使与生物分析仪的未标记样品不分辨，也略高于背景。跟踪。误差条显示三个生物复制的标准错误。请点击此处查看此图的较大版本。 图 2：*-est AID 4U = 最*-est AID 4U 协议的图形摘要。β-雌二醇（β-est）促进辅助蛋白诱导脱粒（AID）系统的表达，该系统反过来会耗尽AID®标记的目标蛋白，参见Barras等人7，了解详细的方案。在这种情况下，脱粒系统表达在蛋白质降解开始前25分钟启动，每个时间点的硫化为1分钟。样品在诱导前采集，在耗尽期间每2分钟采集一次。动画版本出现在补充图 2中。请点击此处查看此图的较大版本。 图3：ACT1 RNA拼接的前体和中间体。通过定量逆转录PCR16监测ACT1前mRNA转录的拼接。ACT1前体（前mRNA）、中间幼虫-外离子2（拉里亚特）和拼接产物（mRNA）的水平根据ACT1 Exon2水平和这些RNA的稳定状态水平进行标准化。（a） qPCR 产品在 ACT1 成绩单上的位置。用于测定ACT1成绩单16前体、中间体和产物的拼接反应水平的qPCR产品的位置图解。Exons 由框表示，intron 表示为线，qPCR 产品表示为两端的钻石线，颜色与图形中使用的颜色相匹配。前mRNA PCR是特定于前mRNA，而不是任何中间体的拼接，因为本产品穿过分支点，这是在第一步拼接后中断。Lariat PCR 将检测拼接的第一步的产品和第二步之后产生的切除的幼虫。mRNA PCR 是拼接产物 mRNA 的特异性。外显子 PCR 的结果（存在于所有前体、中间体和产品中，除切除的喉部外）未显示在图形中，因为用于规范化数据，因此始终等于 1。（b） 连续贴标签。前mRNA的数量随着时间的增大而增加，因为4tU通过转录而合并，经过短暂的延迟后，拼接将其转换为lariat-exon2中间和拼接产物。这些前mRNA和幼虫物种的水平在4tU的生长量达到15s后可检测到，在大约4tU的连续贴标后达到最大值，此时，它们的生产通过转换为拼接来平衡mRNA 和/或降解。值被归化为其稳定状态（图形的最左侧点）和外显子 2 级别，以显示其外观和处理与外显子 2 的转录相比。由于ACT1的RNA拼接主要是共转录4，17拼接mRNA迅速成为最丰富的物种，其水平与外大2相似。三个生物复制的标准误差，每个在三联中测定。（c） 脉冲/追逐。25秒的尿脉冲，然后是尿氨酸的追逐。与这些RNA的稳定状态水平（最左侧的点）相比，它们最初在新合成的池中非常丰富。水平逐渐下降，因为他们被加工成mRNA（或降解），接近水平非常类似于稳定状态水平5分钟。 三个生物复制的标准误差，每个在三重测定。（d） nsRNA和蛋白质消耗.使用图2所述的辅助蛋白脱粒系统消耗Prp16蛋白时，通过定量逆转录PCR监测的ACT1前mRNA转录仪的拼接。Prp16蛋白质水平也显示在针对第二个Y轴绘制的图中，作为辅助蛋白耗尽前的水平百分比。Prp16 是拼接体的重要组成部分，对于面板 （a） 中显示的第二步拼接尤其重要，之后，幼虫会降解。当此步骤变为限制幼虫最初累积时。在以后的点拼接完全失败， 幼虫不再产生和预 mRNA 水平上升.误差条是三个生物复制的标准误差，每个在三次测定中测定。请点击此处查看此图的较大版本。 图 4：协议第 1 和第 3 节的图形摘要。细胞用4tU硫化，允许生长，将修饰的核苷酸合并到RNA中。可以添加一个硫化S. pombe尖峰，以允许跨时间点和实验进行规范化。4tU的脉冲可以使用未脱硫的尿氨酸进行追逐。标签可以从 4tU 添加或从生长条件的变化持续执行，培养分裂和 4tU 添加到培养物在增长条件变化的增加时间，但每个标签只很短的时间。细胞被收集，RNA从细胞中制备，最好使用均质剂和基于酚的方法。RNA是生物仿入，然后生物仿入RNA从非合并生物锡锡中纯化使用大小排除柱。nsRNA现在可以使用链球菌珠进行纯化（第4节，图5）。红色数字对应于协议中的步骤号。请点击此处查看此图的较大版本。 图 5：协议第 4 节的图形摘要。之后，从第1节到第3节（图4），链球菌球珠被阻塞，生物酸化RNA样品加入制备的珠子中。生物小化RNA与链球菌球珠结合，去除并洗涤未生物酸化的RNA。使用βME从珠子中洗脱生物素化RNA，并沉淀为进一步研究做好准备。红色数字对应于协议中的步骤号。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图1：在1分钟和3分钟的硫贴标签下，在有和没有进菌器额外副本的酵母细胞中改善nsRNA恢复。请注意，Fui1是酵母自己的启动子，从2μm质粒表达。该基因的基因组拷贝存在于这两个菌株中。请点击此处下载此文件。 补充图2：动画版本的+-est AID 4U +-est AID 4U图形协议。请点击此处下载此文件。 补充文件1：4tU_实验_模板.xltx。 请点击此处下载此文件。 疟原虫名称 进口商/销售 标记 评论 p4Fui S. 塞雷维西亚·富伊1 乌拉3 Fui1进口乌拉西尔和乌里丁，使其成为脉冲/追逐实验的理想选择。 pAT2 S. 塞雷维西亚·富伊1 勒2 p4Fui-_PEST S. 塞雷维西亚·富伊1 乌拉3 Fui1的PEST图案已被停用，因此当有足够的细胞内尿素满足细胞需求时，渗透不会降解。在标签实验中效果良好，提高了脉冲/追逐性能。 p4Fur 塞雷维西埃·富尔4 乌拉3 乌拉西尔·佩米耶斯 耶普比311 H. 萨皮恩斯 ENT1 勒2 米勒等人11.还含有HSV胸腺素激酶基因。 （平衡核苷传输器） 所有质粒均基于2μm。所有p4质粒和pAT均基于pRS16系列质粒。FUI1和FUR4由它们自己的内源促进者表达。 表1：与该协议一起使用的质粒。
Discussion
本文提出了一种极快速和特异性4tU标签的协议，用于在低至15s的标签后从S.cerevisiae中回收新生的、新合成的RNA，并且无标记RNA的污染极低。
用户应始终注意使用低温和DEPC处理试剂来保持RNA的完整性。链球菌珠子纯化一般可靠;然而，珠子缓冲器难以处理;它必须新鲜制成，其组件按正确的顺序添加，而不是冷藏或高压灭。常见的缺陷包括RNA在沉淀步骤后不完全溶解，因此在加工步骤中要么没有生物酸化，要么丢失。补充材料中提供了广泛的故障排除帮助。
在 ers4tU 中需要注意一些限制。其中已经提到一个是4tU减缓酵母的生长（图1a）。除内皮硫化RNA9外，只有标签期内转录的RNA才能用这种方法进行纯化。在整个硫化期间，在基因上暂停的聚合体不会产生可纯化的硫化转录，尽管由于聚合器在硫化期间进入或离开暂停状态而部分标记的转录本可以恢复。由于突变或生长条件，转录不良的菌株产生很少的nsRNA，尽管与其他方法相比，这里使用的技术将改善nsRNA的恢复。在这些菌株和条件下，可能需要更长的时间和增加的培养量。请注意，尿素是氮的良好来源，因此在用于氮饥饿研究之前，应先试用此方法。
ers4tU 协议对于分析短寿命 RNA 特别有用，其中许多RNA的降解速度非常快，如果不破坏降解机制，就无法识别它们。例子包括神秘的不稳定转录本（CUTs）4，以及由过早终止或促进者近暂停18产生的短抄本，以及从启动子（PROMPTs）19中产生的反义转录”上游”。在稳定RNA物种的加工过程中产生的中间体也是暂时性的，但可以使用ers4tU转录4进行浓缩。因此，ers4tU 协议在允许在近生理条件下分析和捕获高瞬态 RNA 物种方面非常特殊，这与其他方法具有巨大的优势。该技术已用于研究RNA聚合酶突变体中的转录和下游RNA处理动力学，这些突变体比正常20更快地或慢拉长。
硫化还与RNA-seq和SLAM-seq21兼容，允许在很短的时间内产生的所有RNA以精美的细节来描述。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了井康对JB[104648]的资助。韦康细胞生物学中心的工作得到了威尔康核心基金的支持[092076]。作者感谢实验室成员的帮助：贝拉·莫德林、伊曼纽拉·萨尼、苏珊娜·德·卢卡斯-阿里亚斯和希尼·乔治。作者还要感谢帕特里克·克莱默的质粒YEpEBI3111。
Materials
| β-mercaptoethanol (βME) | Sigma-Aldrich | M3148 | CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 25668 | CAUTION toxic |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave |
| DMF (N,N-dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | 227056 | CAUTION toxic |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 29221 | |
| EZ-link HPDP Biotin | Thermo scientific | 21341 | Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend. |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
| Glycogen [20 mg/mL] | Sigma-Aldrich | 10901393001 | Store at -20 °C |
| Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel | Thermo Scientific | 77712 | Optional |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 793620 | 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly. |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63033 | 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly. |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-M | 5 M solution |
| Phenol, low pH. | Sigma-Aldrich | P4682 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
| Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH. | Sigma-Aldrich | P1944 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
| Pierce Spin Columns | Thermo Scientific | 69702 | Optional |
| SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | 32318-M | Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | CAUTION corrosive |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Sigma-Aldrich | 436143 | CAUTION irritant, do not inhale |
| Streptavidin Magnetic beads | NEB | 1420S | Store at 4°C |
| SUPERase-In, RNase inhibitor | Life technologies | AM2696 | Store at -20°C |
| Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike | See section 1.7 of the protocol | ||
| 4-thiouracil (4tU) | ACROS ORGANICS | 359930010 | Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | 1 M solutions at various pH |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | 5mg/ml, store at -20°C |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C. |
| Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 | |
| Zeba Columns 0.5ml | Thermo Scientific | 89882 | Store at 4 °C |
| Zirconia beads | Thistle Scientific | 110791052 | |
| Equipment and Consumables | |||
| Beadbeater | Biospec | 112011EUR | Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established. |
| Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA. | |||
| Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible. | |||
| Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g | |||
| Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist | |||
| PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark. | |||
| Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end | |||
| Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended | |||
| Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL | Eppendorf | H179467N | |
| Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL | Ambion | AM12350 | |
| Tubes, centrifuge, 50 mL | Sarstedt | 62.547.004 | Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss |
| Tubes, centrifuge, 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 | |
| Tubes, 2 mL, screw cap | Greiner | 723361 | |
| Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids | Brand | 781332 | |
Referencias
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Citar este artículo
Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).