JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Published: September 19, 2019
doi:
10.3791/59950
, , , ,
1The Children’s Hospital, School of Medicine,Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine,Zhejiang University

Summary

Burada, immünororesans boyama ve DNA nokta-leke yöntemleri kullanarak, hücre ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitozin tespit etmek için bir protokol salıyoruz.

Abstract

Memeli genomunda birden fazla DNA modifikasyonu tespit edilmiştir. Bunun 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin aracılı epigenetik mekanizmaları yoğun olarak çalışılmıştır. 5-hidroksimetilsitozin beynin embriyonik ve doğum sonrası gelişimi sırasında dinamik özellikler gösterir, gen ekspresyonunda düzenleyici bir işlev oynar ve birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır. Burada, kültürlü hücrelerde ve farenin beyin dokularında 5-hidroksimetilitozini saptamak için immünoresans boyama ve DNA nokta-leke dahil olmak üzere ayrıntılı yöntemleri açıklıyoruz.

Introduction

DNA modifikasyonu, histon modifikasyonu ve RNA modifikasyonu da dahil olmak üzere epigenetik modifikasyonlar, çeşitli biyolojik süreçler vehastalıklardatemel işlevleri oynamak için gösterilmiştir 1,2,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Uzun bir süre için, DNA metilasyon (yani, 5-metisitozin (5-mC)) son derece istikrarlı bir epigenetik belirteç olarak görülüyor ve daha fazla genom değiştirilemez. Son zamanlarda, 5-mC TET1, TET2 ve TET38,9dahil olmak üzere TET (Ten-onbir translokasyonlar) aile proteinleri tarafından 5-hidroksimetilsitozin (5-hmC) oksitlenmiş olabilir bulunmuştur. Daha ileri çalışmalar 5-hmC istikrarlı bir belirteç olarak hizmet verebilir ve gen ekspresyonudüzenleyen4,10,11,12ile biyolojik roller oynayabilir göstermektedir.

Mevcut kanıtlar 5-hmC yüksek memelilerde dokuların diğer türlerine göre nöronal dokularda / hücrelerde zenginleştirilmiş olduğunu göstermektedir, ve nöronal gelişim sırasında dinamik özellikler sergiler13,14. Nöronal sistemde, 5-hmC aracılı epigenetik değişiklikler nöral kök hücrelerin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, nöronal aktivite, öğrenme ve bellek, ve Rett sendromu dahil olmak üzere birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır, otizm, Alzheimer hastalık, Huntington hastalığı, vb2,13,15,16,17,18,19,20.

Hücre ve dokularda 5-hmC tespit etmek için çeşitli yaklaşımlar vardır14,21,22,23,24. Burada, 5-hmC varlığını tespit etmek ve 5-hmC küresel düzeyini ölçmek için iki yöntem açıklar: immünoresans boyama ve DNA nokta-blot. Bu iki yöntem uygun ve duyarlı, ve başarıyla önceki çalışmalarda kullanılmıştır25,26,27,28,29,30. Bu iki yöntemin temel adımları DNA denatürasyonuvardır. 5-hmC immünoresans boyama için 1 M HCl’li numunelerin ön tedavisi gereklidir. 5-hmC nokta-blot için DNA denatürasyonu NaOH çözeltisi ile yapılır. Yeni nesil sıralama ile birlikte bu iki yöntem 5-hmC işlevini araştırmak için çok yararlı araçlardır.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Zhejiang Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Yetişkin Nöral Kök Hücre ve Nöronların Kültürü Daha önce açıklandığı gibi bir yetişkin (8-10 haftalık) C57/BL6 erkek fare ön beyin yetişkin nöral kök hücreleri izole31,32. DMEM/F-12 ortamlarında 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, %2 B27 takviyesi, %1 antibiyotik antimikotik ve %5 CO2 in…

Representative Results

Erişkin farelerin hipokampusundaki 5-hmC dağılımını ortaya çıkarmak için nöronal hücrelere (NeuN) ve 5-hmC’ye karşı antikorlarla immünorfloresans uyguladık. Hipokampus, 5-hmC nöronal hücre belirteci NeuN ile iyi lokalize (Şekil 1A-H), nöronlarda 5-hmC bir zenginleştirme düşündüren. Nöronal gelişim sırasında 5-hmC’nin dinamiklerini belirlemek için ilk olarak çoğalan ve farklılaşmış erişkin nöral kök hücrelerde…

Discussion

Epigenetik modifikasyonlar beyin gelişimi, olgunlaşma ve fonksiyon sırasında önemli roller oynar. DNA modifikasyonu için kararlı bir belirteç olarak, dinamik 5-hmC davranışsal adaptasyon, nöronal aktivite yanıt verir ve pozitif gen ekspresyonu ile ilişkilidir; böylece, beyin ve nörolojik bozukluk4normal fonksiyonu nda yer almaktadır. Hücre ve dokularda işlevini keşfetmek için, 5-hmC varlığını tespit etmek ve tedavi öncesi ve sonrası düzeyini karşılaştırmak için gere…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XL kısmen Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFE0196600) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 31771395, 31571518) tarafından desteklenmiştir. S.S. Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFC1001703) ve Zhejiang Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017C03009) tarafından desteklenmiştir. W.X. Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY18H020002) ve Zhejiang Eyaleti Bilim Teknolojisi Bölümü (2017C37057) tarafından desteklenmiştir.

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
neurobasal medium Gibco 21103-049
normal goat serum Vector Laboratories Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
proteinase K VVR 39450-01-6
retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer’s disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer’s disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Tags

5-hydroxymethylcytosine5hmCImmunofluorescenceDNA Dot-blotNeural Stem CellsMouse BrainEpigenetic ModificationGene ExpressionNeurological DisordersPerfusionFixationCryosectioningImmunostaining

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image