Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade
Summary
Denne protokollen demonstrerer samtidig påvisning av reaktive oksygenarter (ROS), levende celler og døde celler i levende primære kulturer fra musen okulære overflateceller. 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium jodid, og Hoechst farging brukes til å vurdere ROS, døde celler, og levende celler, henholdsvis, etterfulgt av bildebehandling og analyse.
Abstract
Okulær overflate er utsatt for vanlig slitasje på grunn av ulike miljøfaktorer. Eksponering for UV-C-stråling utgjør en helsefare på arbeidsplassen. Her viser vi eksponeringen av primære stamceller fra musenokulær overflate til UV-C-stråling. Reaktiv oksygenart (ROS) dannelse er avlesningen av omfanget av oksidativt stress/ skade. I en eksperimentell in vitro-innstilling er det også viktig å vurdere prosentandelen av døde celler som genereres på grunn av oksidativt stress. I denne artikkelen vil vi demonstrere 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) farging av UV-C eksponert mus primære okulær overflate stamceller og deres kvantifisering basert på fluorescerende bilder av DCFDA farging. DCFDA farging direkte tilsvarer ROS generasjon. Vi viser også kvantifisering av døde og levende celler ved samtidig farging med propidiumjodid (PI) og Hoechst 3332 henholdsvis og prosentandelen av DCFDA (ROS positive) og PI positive celler.
Introduction
Okulær overflate (OS) er en funksjonell enhet hovedsakelig består av det ytre laget og kjertelepitelen av hornhinnen, lachrymal kjertel, meibomian kjertel, conjunctiva, en del av øyelokkmarginer og innerveringer som transduce signaler1. Det gjennomsiktige kuppelformede hornhinnen legger fokus på netthinnen. Dette avaskulære vevet består av cellulære komponenter som epitelceller, keratocytter og endotelceller og acellulære komponenter som kollagen og glykosaminoglykaner2. Området er drenert av tårer som også forsyner de fleste næringsstoffene. Os anatomiske posisjon tvinger det til å være i direkte kontakt med det ytre miljøet, og utsetter det ofte for ulike harde komponenter som sterkt lys, mikrober, støvpartikler og kjemikalier. Denne faktoren predisponerer operativsystemet for fysiske skader og gjør det utsatt for ulike sykdommer.
Oksidativt stress skyldes disequilibrium mellom produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og endogene antioksidantforsvarsmekanismer3. ROS er klassifisert i reaktive molekyler og frie radikaler, som begge er avledet fra molekylært oksygen (O2) gjennom mitokondrieoksidatorylering4. Den tidligere gruppen består av ikke-radikale arter som hydrogenperoksid (H2O2),enkeltoksygen (1O2) og sistnevnte inkluderer blant annet arter som superoksidanioner (O2–) og hydroksylradikaler (•OH). Disse molekylene er biprodukter av normale cellulære prosesser og deres roller har vært innblandet i viktige fysiologiske funksjoner som signaltransduksjon, genuttrykk og vertsforsvar5. En forbedret produksjon av ROS er kjent for å bli generert som svar på faktorer som patogen invasjon, xenobiotika, og eksponering for ultra fiolett (UV) stråling4. Denne overproduksjonen av ROS resulterer i oksidativt stress som fører til skade på molekyler som nukleinsyrer, proteiner og lipider6.
Naturlig sollys, den mest dominerende kilden til UV-stråling, består av UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) og UV-C (290–200 nm)7. En invers sammenheng mellom bølgelengden og spektralenergiene er rapportert. Selv om naturlige UV-C-strålinger absorberes av atmosfæren, avgir kunstige kilder som kvikksølvlamper og sveiseinstrumenter, og utgjør derfor en yrkesfare. Symptomer på eksponering for øyne inkluderer fotokeratitt og fotokeratoconjunctivitis8. Produksjon av ROS er en av de viktigste mekanismene for å påføre UV-indusert cellulær skade9. I den nåværende studien viser vi påvisning av ROS ved hjelp av 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) farging ser metode i musen primære okulære overflateceller / stamceller utsatt for UV-C. Den grønne fluorescensen ble fanget ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Cellene var motfarget med to fargestoffer, Hoechst 33342 og rød propidiumjodid, for å beise de levende og døde cellene, henholdsvis.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFDA farging metoden beskrevet her muliggjør visualisering av ROS i musen primære okulære levende celler behandlet med UV-C stråling. En fordel med denne fargemetoden er at det også gjør det mulig for forskerne å studere de umiddelbare effektene av UV-C (3 timer etter UVC-eksponering) på levende celler og deres samtidige opplisting for prosentandelen av ROS-positive, så vel som døde celler. Videre, som farging metoden brukes på levende celler, cellene kan bli ytterligere inkubert i samme media i lengre tid (f…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner støtte fra Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Anses å være Universitet) for de infrastrukturelle anleggene.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
Referencias
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Biología del desarrollo. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
