Målet med protokollet är att illustrera de olika analyser som avser viral inmatning som kan användas för att identifiera kandidat virus inläggs hämmare.
Antiviral analyser som mekanistiskt undersöka viral inträde är relevanta för att urskilja vid vilken steg de utvärderade agenterna är mest effektiva, och möjliggöra identifiering av kandidaten viral Entry-hämmare. Här presenterar vi experimentella metoder för identifiering av små molekyler som kan blockera infektion av den icke-höljeförsedda coxsackievirus A16 (CVA16) genom att rikta in viruspartiklarna eller specifika steg i tidig viral inmatning. Analyser inkluderar tid-av-drog-addition analys, flödescytometri-baserade viral binding assay, och viral inaktivering assay. Vi presenterar också ett molekylärt docknings protokoll som utnyttjar virus kapsid proteiner för att förutsäga potentiella rester riktade av de antivirala föreningarna. Dessa analyser bör bidra till att identifiera kandidat antivirala medel som verkar på viral inträde. Framtida riktningar kan utforska dessa möjliga hämmare för ytterligare läkemedelsutveckling.
Hand-, mul-och klövsjuka (HFMD) är en sjukdom som oftast orsakas av coxsackievirus A16 (CVA16) och enterovirus 71 (EV71) hos små barn. Nyligen i hela Asien och Stillahavsområdet, det har varit en betydande uptick i CVA16-inducerad HFMD. Medan symtomen kan vara lindriga, allvarliga komplikationer kan förekomma som påverkar hjärnan och hjärtat, med potentiell dödsfall1,2. För närvarande finns det inga licensierade antivirala terapier eller vaccinationer tillgängliga för CVA16, och därför finns det ett trängande behov av att utveckla antivirala strategier för att bromsa framtida utbrott och tillhörande komplikationer.
CVA16 är en icke-höljeförsedda virus som har en ikosaedrisk kapsid monteras från pentamers att varje innehåller 4 strukturella proteiner nämligen VP1, VP2, VP3, och VP4. Omslutande varje femfaldig axel i pentamer är en “Canyon” region som visar som en depression och är känd för sin roll i receptorbindning3. Längst ner i denna kanjon ligger en hydrofoba ficka i VP1 regionen som innehåller en naturlig fet ligand som heter sfingosin (SPH). Cellulära receptorer, såsom humant P selektin glykoprotein ligand 1 (psgl-1) och Scavenger receptor klass B medlem 2 (SCARB2), har föreslagits för att spela en roll i viral bindning genom att förtränga denna ligand vilket resulterar i överensstämmande förändringar till kapsid och efterföljande utmatning av viral genomet till värdcellen4,5,6. Identifiera möjliga hämmare som blockerar de successiva händelserna i viral Entry-processen kan ge potentiella terapeutiska strategier mot CVA16 infektion.
Stegen i virusets livscykel kan dissekeras genom experimentella metoder som mål för att hjälpa till att identifiera läge-specifika antivirala medel. En tid-av-drog-addition analys undersöker läkemedelsbehandling effekt vid olika tidpunkter under virusinfektion, inklusive pre-entry (läggas före virusinfektion), inträde (läggas till samtidiga viruset infektion), och post-entry (läggas till efter virusinfektion)7. Effekten kan bedömas med hjälp av en vanlig plack-analys genom att kvantitera antalet virala plack som bildas i vart och ett av behandlings villkoren. Flödet cytometry-baserade viral binding assay avgör om drogen förhindrar viral fastsättning att vara värdceller. Detta uppnås genom att temperaturen förskjuts från 37 ° c, vid vilken majoriteten av humana virusinfektioner uppträder, till 4 ° c, där virionerna kan binda till värdcellytan men inte kan komma in i cellerna7. De cellmembran bundna viruspartiklarna kvantifieras sedan genom immunofärgning mot virala antigener och bedöms av flödescytometri. Viral inaktivering assay å andra sidan hjälper till att bedöma potentiella fysiska interaktioner av drogen med fria viruspartiklar, antingen avskärmning eller neutralisera virionerna, eller orsakar aggregeringar eller överensstämmande förändringar som gör dem inaktiva för efterföljande interaktioner med värd cells ytan under infektionen8,9. I detta experiment, viral inokulum är tillåtet att först Inkubera med drogen innan de späds att titrera ut drogen innan infektera värdcellen enskiktslager och utföra en standard plack assay8. Slutligen, molekylär dockning är ett kraftfullt verktyg för att förutsäga potentiella läkemedelsinteraktioner webbplatser på spjälkat virus ytan, inklusive viral glykoproteiner från höljeförsedda virus och viral kapsid proteiner från icke-höljeförsedda virus, med hjälp av Computational Algoritmer. Detta bidrar till att mekanistiskt precisera mål av läkemedlets verkningssätt och ge användbar information som kan ytterligare valideras av nedströms analyser.
Vi anställde nyligen ovan beskrivna metoder för att identifiera antivirala föreningar som effektivt blockerade infektion av icke-höljeförsedda CVA169. Häri beskrivs och diskuteras de detaljerade protokollen som användes.
I denna rapport beskrev vi de protokoll som är användbara för identifiering av antivirala kandidater som inriktar sig på viral inmatning, särskilt mot icke-höljeförsedda CVA16. Analyserna är utformade på ett sätt att dissekera de tidiga händelserna under viral Entry, vilket är bra att klargöra mekanismen (s) åtgärder och potentiella mål (er) av test agenterna ‘ antiviral aktivitet. “Tid-för-drog-addition-analysen” medger att i stort sett fastställa det potentiella målet för test föreningarna, till ex…
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för Dr Joshua Beckham vid University of Texas i Austin för teknisk support med molekylär dockning. Denna studie stöddes delvis av finansiering från Taiwans vetenskaps-och teknik ministerium (MOST107-2320-B-037-002 till C.-J.L. och L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 och MOST107-2320-B-038-034-MY3 nätters till L.-T.L.).
4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
Corina | Molecular Networks GmbH | ||
Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
DMSO | Sigma | D5879 | |
FBS | GIBCO | 26140-079 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Graphpad Prism | GraphPad | ||
Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
PyMol | Schrödinger | ||
UCSF Chimera | University of California, San Francisco |