Coxsackievirus A16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용
Summary
프로토콜의 목적은 후보 바이러스 진입 억제제를 식별하는 데 사용될 수 있는 바이러스 입력과 관련된 상이한 분석방법을 설명하는 것이다.
Abstract
기계론적으로 바이러스 진입을 검사하는 항바이러스 분석제는 평가된 에이전트가 가장 효과적인 단계를 분별하는 것과 관련이 있으며, 후보 바이러스 진입 억제제의 식별을 허용한다. 여기서, 우리는 초기 바이러스 진입에서 바이러스 입자 또는 특정 단계를 표적으로 하여 비봉투콕사키바이러스 A16(CVA16)에 의한 감염을 차단할 수 있는 소분자의 식별을 위한 실험접근법을 제시한다. 분석법은 약물 첨가 시간 분석, 유세포분석계 바이러스 결합 분석, 및 바이러스 불활성화 분석기를 포함한다. 우리는 또한 항 바이러스 화합물에 의해 표적으로 한 잠재적인 잔류물을 예측하기 위하여 바이러스 capsid 단백질을 이용하는 분자 도킹 프로토콜을 제시합니다. 이 해법은 바이러스 성 진입에 작용하는 후보 항 바이러스 에이전트의 확인에 도움이 될 것입니다. 미래의 방향은 추가 약물 개발을 위한 이러한 가능한 억제제들을 탐구할 수 있다.
Introduction
손, 발 및 구강 질환(HFMD)은 어린 아이들의 콕사키바이러스 A16(CVA16) 및 엔테로바이러스 71(EV71)에 의해 가장 흔하게 발생하는 질환이다. 최근 아시아 태평양 지역에서 CVA16 유도 HFMD에 상당한 상승세가 있었습니다. 현상이 온화할 수 있는 동안, 가혹한 합병증은 잠재적인치명적인 1,2와함께 두뇌와 심혼에 영향을 미치는 생길 수 있습니다. 현재 CVA16에 사용할 수있는 허가 된 항 바이러스 요법이나 예방 접종은 없으므로 향후 발병 및 관련 합병증을 억제하기위한 항 바이러스 전략을 개발할 필요성이 절실히 필요합니다.
CVA16은 각각 VP1, VP2, VP3 및 VP4와 같은 4개의 구조 단백질을 포함하는 펜타머에서 조립된 이코사헤드랄 캡시드가 있는 비봉투 바이러스입니다. 펜타머에서 각 5 배 축을 둘러싸는 것은 우울증으로 표시하고 수용체 결합 3에서의역할로 지적되는 ‘협곡’영역입니다. 이 협곡의 하단에는 스핑고신(SPH)이라는 천연 지방 리간드가 들어 있는 VP1 부위에 소수성 포켓이 있습니다. 인간 P 셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL-1) 및 스캐빈저 수용체 클래스 B 부재 2(SCARB2)와 같은 세포 수용체는 캡시드및 캡시드에 대한 형태 적 변화를 초래하는 이 리간드를 대체함으로써 바이러스 결합에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 호스트 세포로 바이러스 게놈의후속 배출 4,5,6. 바이러스 진입 과정에서 연속적인 사건을 차단하는 가능한 억제제를 식별하면 CVA16 감염에 대한 잠재적 인 치료 전략을 제공 할 수 있습니다.
바이러스 수명 주기의 단계는 모드 특정 항 바이러스 제를 식별하는 데 도움이되는 표적으로 실험적 접근을 통해 해부 될 수 있습니다. 약물 첨가 시간 분석은 사전 진입(바이러스 감염 이전에 추가), 항목(바이러스 감염에 동시 추가), 및 사후 진입(다음에 추가됨)을 포함하여 바이러스 감염 중 다른 시간에 약물 치료 효과를 검사합니다. 바이러스 감염)7. 충격은 각각의 처리 조건에서 형성된 바이러스 성 플라크의 수를 정량화함으로써 표준 플라크 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 유세포분석기반 바이러스 결합 분석법은 약물이 숙주 세포에 대한 바이러스 부착을 방지하는지 여부를 결정한다. 이는 대부분의 인간 바이러스 감염이 발생하는 37°C에서 4°C로 온도를 이동시킴으로써 달성되며, 여기서 비리온은 숙주 세포 표면에 결합할수 있지만 세포 7에 들어갈 수 없다. 세포막 결합된 바이러스 입자는 그 때 바이러스 성 항원에 대하여 면역 염색을 통해 정량화되고 유세포 측정에 의해 평가됩니다. 한편 바이러스 성 불활성화 분석은 비활성 을 렌더링 하는 응집 또는 구성 변화를 일으키는 무료 바이러스 입자와 약물의 잠재적인 물리적 상호 작용을 평가 하는 데 도움이, 차폐 또는 중화, 또는 그들을 비활성 렌더링 하는 조직 변화 감염 동안 호스트 세포 표면과후속 상호 작용 8,9. 본 실험에서, 바이러스 성 접종은 숙주 세포 단층을 감염시키고 표준 플라크 분석8을수행하기 전에 약물을 적정하기 위해 희석되기 전에 약물을 먼저 배양할 수 있다. 마지막으로, 분자 도킹은 비봉투 바이러스의 바이러스 성 당단백질과 비봉투 바이러스의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하여 비리온 표면의 잠재적인 약물 상호 작용 부위를 예측하는 강력한 도구입니다. 알고리즘. 이것은 기계론적으로 약물의 행동 모드의 표적을 찾아내고 다운스트림 검아에 의해 추가로 검증될 수 있는 유용한 정보를 제공하는 것을 돕습니다.
우리는 최근에 비 봉투 CVA16 9에 의해 감염을 효율적으로 차단하는 항바이러스 화합물을 식별하기 위해 전술 한 방법을 채택했다. 본 명세서에서, 사용된 상세한 프로토콜들이 기술되고 논의된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에서, 우리는 특히 비 포위 된 CVA16에 대하여 바이러스 입력을 표적으로 하는 항 바이러스 후보의 식별에 유용한 프로토콜을 기술했습니다. 이 실험은 바이러스 진입 중에 초기 이벤트를 해부하는 방법으로 설계되었으며, 이는 시험에이전트의 항바이러스 활성의 작용 메커니즘과 잠재적 표적(들)을 명확히 하는 데 도움이 된다. ‘약물 첨가 시간’은 시험 화합물의 잠재적 표적, 예를 들어 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 분자 도킹기술 지원을 위해 오스틴에 있는 텍사스 대학에 조슈아 베컴 박사에게 감사하고 있습니다. 이 연구는 부분적으로 대만 의 과학 기술부 (MOST107-2320-B-037-037-002에서 C.-J.L. 및 L.-T.L.에 대한 자금 지원으로 지원되었습니다. MOST106-2320-B-038-021 및 MOST107-2320-B-038-034-MY3- L.-T.L.)
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
Referencias
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