Verwendung von Viral Entry Assays und Molekulardocking-Analysen zur Identifizierung antiviraler Kandidaten gegen Coxsackievirus A16
Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, die verschiedenen Assays im Zusammenhang mit viralen Eintritte zu veranschaulichen, die verwendet werden können, um Kandidaten-Virus-Eintrittshemmer zu identifizieren.
Abstract
Antivirale Assays, die den viralen Eintrag mechanistisch untersuchen, sind relevant, um zu erkennen, in welchem Schritt die bewerteten Wirkstoffe am effektivsten sind, und die Identifizierung von Kandidaten-Virus-Eintrittshemmern zu ermöglichen. Hier stellen wir die experimentellen Ansätze zur Identifizierung kleiner Moleküle vor, die eine Infektion durch das nicht umhüllte Coxsackievirus A16 (CVA16) blockieren können, indem sie auf die Viruspartikel oder bestimmte Schritte bei der frühen viralen Eintierung abzielen. Assays umfassen die Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition, Flusszytometrie-basierte virale Bindung Assay, und virale Inaktivierung Assay. Wir präsentieren auch ein molekulares Docking-Protokoll, das Virus-Capsid-Proteine verwendet, um potenzielle Rückstände vorherzusagen, die von den antiviralen Verbindungen angegriffen werden. Diese Assays sollten bei der Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen helfen, die auf den viralen Eintrag wirken. Zukünftige Richtungen können diese möglichen Inhibitoren für die weitere Arzneimittelentwicklung erforschen.
Introduction
Die Hand-, Fuß- und Mundkrankheit (HFMD) ist eine Krankheit, die am häufigsten durch das Coxsackievirus A16 (CVA16) und das Enterovirus 71 (EV71) bei Kleinkindern verursacht wird. Kürzlich gab es im gesamten asiatisch-pazifischen Raum einen deutlichen Anstieg der CVA16-induzierten HFMD. Während die Symptome leicht sein können, können schwere Komplikationen auftreten, die das Gehirn und das Herz betreffen, mit potenzieller Todesfall1,2. Derzeit gibt es keine zugelassenen antiviralen Therapien oder Impfungen für CVA16, und daher besteht die dringende Notwendigkeit, antivirale Strategien zu entwickeln, um zukünftige Ausbrüche und die damit verbundenen Komplikationen einzudämmen.
CVA16 ist ein nicht umhülltes Virus, das ein ikosaedrales Kapsid aus Pentamern hat, die jeweils 4 strukturelle Proteine enthalten: VP1, VP2, VP3 und VP4. Umgibt jede fünffache Achse in den Pentamer ist eine “Canyon”-Region, die als Depression zeigt und für ihre Rolle in der Rezeptorbindung3bekannt ist. Am Boden dieser Schlucht liegt eine hydrophobe Tasche in der VP1-Region, die einen natürlichen Fettligand namens Sphingosin (SPH) enthält. Zelluläre Rezeptoren, wie z. B. humanes P-Selgin-Glykoprotein-Ligand 1 (PSGL-1) und Scavenger-Rezeptor-Klasse B-Mitglied 2 (SCARB2), wurden vorgeschlagen, eine Rolle bei der viralen Bindung zu spielen, indem dieser Liganden verdrängt wird, was zu Konformationsänderungen am Kapsid und anschließender Auswurf des viralen Genoms in die Wirtszelle4,5,6. Die Identifizierung möglicher Inhibitoren, die die aufeinanderfolgenden Ereignisse im viralen Eintrittsprozess blockieren, könnte potenzielle therapeutische Strategien gegen eine CVA16-Infektion liefern.
Die Schritte im Viruslebenszyklus können durch experimentelle Ansätze als Ziele zur Identifizierung modusspezifischer antiviraler Wirkstoffe seziert werden. Eine Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition untersucht die Arzneimittelbehandlungswirkung zu verschiedenen Zeiten während der Virusinfektion, einschließlich Pre-Entry (vor der Virusinfektion hinzugefügt), Eintrag (gleichzeitig zur Virusinfektion hinzugefügt) und Post-Entry (hinzugefügt nach dem Virusinfektion)7. Die Auswirkungen können mit einem Standard-Plaque-Assay bewertet werden, indem die Anzahl der viralen Plaques quantifiziert wird, die in jeder der Behandlungsbedingungen gebildet werden. Der Strömungszytometrie-basierte virale Bindungstest bestimmt, ob das Medikament die virale Bindung an Wirtszellen verhindert. Dies wird erreicht, indem die Temperatur von 37 °C, bei der die Meisten Infektionen mit menschlichen Viren auftreten, auf 4 °C verschoben wird, wo die Virionen in der Lage sind, sich an die Oberfläche der Wirtszelle zu binden, aber nicht in die Zellen7gelangen können. Die zellmembrangebundenen Viruspartikel werden dann durch Immunfärbung gegen virale Antigene quantifiziert und durch Durchflusszytometrie bewertet. Der virale Inaktivierungstest hingegen hilft, mögliche physikalische Wechselwirkungen des Arzneimittels mit freien Viruspartikeln zu bewerten, entweder die Virionen abzuschirmen oder zu neutralisieren oder Aggregationen oder Konformationsänderungen zu verursachen, die sie für nachfolgende Wechselwirkungen mit der Wirtszelloberfläche während der Infektion8,9. In diesem Experiment darf das virale Inokulum zuerst mit dem Medikament inkubieren, bevor es verdünnt wird, um das Medikament vor der Infektion der Wirtszellmonolayer zu titrieren und einen Standard-Plaque-Assaydurchzuführen 8. Schließlich ist das molekulare Andocken ein leistungsfähiges Werkzeug, um potenzielle Wechselwirkungsstellen für Arzneimittel auf der Virionenoberfläche vorherzusagen, einschließlich der viralen Glykoproteine von umhüllten Viren und der viralen Kapsidproteine von nicht umhüllten Viren, indem computergestützte Algorithmen. Dies hilft, mechanistisch Ziele der Wirkungsweise des Medikaments zu lokalisieren und nützliche Informationen zu liefern, die durch nachgelagerte Assays weiter validiert werden können.
Wir haben vor kurzem die oben beschriebenen Methoden verwendet, um antivirale Verbindungen zu identifizieren, die eine Infektion durch das nicht umhüllte CVA169effizient blockierten. Hierin werden die verwendeten detaillierten Protokolle beschrieben und diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht haben wir die Protokolle beschrieben, die für die Identifizierung antiviraler Kandidaten nützlich sind, die auf die Viruseingabe abzielen, insbesondere gegen die nicht umhüllte CVA16. Die Assays sind so konzipiert, dass die frühen Ereignisse während des viralen Eintrags sezieren, was hilfreich ist, um den Wirkmechanismus(n) und die potenziellen Ziele der antiviralen Aktivität der Testmittel zu klären. Der “Time-of-Drug-Addition ssay” ermöglicht es, das potenzielle Ziel der Testverbindungen, z. B…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Joshua Beckham von der University of Texas at Austin für die technische Unterstützung beim molekularen Andocken. Diese Studie wurde teilweise durch Fördermittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie Taiwans (MOST107-2320-B-037-002 bis C.-J.L. und L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 und MOST107-2320-B-038-034-MY3 bis L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
Referencias
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
