Anvendelse af viral Entry assays og molekylær docking-analyse til identifikation af antivirale kandidater mod coxsackievirus A16

Mund-, mund-og klovesyge (HFMD) er en sygdom, der oftest forårsages af coxsackievirus A16 (CVA16) og enterovirus 71 (EV71) hos små børn. For nylig i Asien-Stillehavsområdet har der været en betydelig stigning i CVA16-induceret HFMD. Mens symptomerne kan være milde, kan der opstå svære komplikationer, som påvirker hjernen og hjertet, med potentiel dødsfald^1,2. På nuværende tidspunkt er der ingen licenserede antivirale behandlinger eller vaccinationer til rådighed for CVA16, og derfor er der et presserende behov for at udvikle antivirale strategier til at bremse fremtidige udbrud og de tilhørende komplikationer.

CVA16 er en ikke-kappeklædte virus, der har en icosahedral kapsid samlet fra pentamers, der hver indeholder 4 strukturelle proteiner, nemlig VP1, VP2, VP3, og VP4. Omkranser hver femdobling akse i pentamer kosmetisk er en ‘ Canyon ‘ region, der viser som en depression og er kendt for sin rolle i receptor binding³. I bunden af denne Canyon ligger en hydrofobe lomme i VP1-regionen, der indeholder en naturlig fed ligand, der hedder sphingosin (sph). Cellulære receptorer, såsom humant P molekylet glykoprotein ligand 1 (psgl-1) og Scavenger receptor klasse B-medlem 2 (SCARB2), er blevet foreslået til at spille en rolle i viral binding ved at forlede dette ligand, hvilket resulterer i konformationelle ændringer af kapsid og efterfølgende udslyngning af viral genom i værtscellen^4,5,6. Identificering af mulige inhibitorer, der blokerer de successive hændelser i viral indrejse processen kunne give potentielle terapeutiske strategier mod CVA16 infektion.

Trinene i virus livscyklus kan dissekeret gennem eksperimentelle tilgange som mål for at hjælpe med at identificere mode-specifikke antivirale midler. En time-of-Drug-tilsætning analyse undersøger narkotikabehandling effekt på forskellige tidspunkter under virus infektion, herunder pre-Entry (tilføjet før virus infektion), indrejse (tilføjet samtidig med virus infektion), og post-Entry (tilføjet efter virus infektion)⁷. Virkningen kan vurderes ved hjælp af en standard plaque-analyse ved at kvantitere antallet af virale plaques dannet under hver af behandlingsbetingelserne. Den flowcytometri-baserede viral binding analyse afgør, om lægemidlet forhindrer viral fastgørelse til værtceller. Dette opnås ved at flytte temperaturen fra 37 °C, hvor størstedelen af menneskelige virusinfektioner forekommer, til 4 °C, hvor virions er i stand til at binde til værtscellens overflade, men er ude af stand til at komme ind i cellerne⁷. De celle membranbundne viruspartikler kvantificeres derefter ved immun farvning mod virale antigener og vurderes af flowcytometri. Viral inaktivering assay på den anden side hjælper med at vurdere potentielle fysiske interaktioner af lægemidlet med gratis viruspartikler, enten afskærmning eller neutralisering af virions, eller forårsager aggregeringer eller konformationelle ændringer, der gør dem inaktive for efterfølgende interaktioner med værtscellens overflade under infektionen^8,9. I dette eksperiment er viral inokulum tilladt først at inkubere med lægemidlet, før det fortyndes for at titrere lægemidlet, inden det inficerer værtscellens enkeltlags og udfører en standard plaque-analyse⁸. Endelig er molekylær docking et effektivt værktøj til at forudsige potentielle lægemiddel interaktions steder på virion-overfladen, herunder de virale glykoproteiner fra kappeklædte vira og de virale kapsid-proteiner fra ikke-kappeklædte vira, ved hjælp af Computational Algoritmer. Dette hjælper til mekanisk at udpege mål for narkotika virkningsmekanisme og give nyttige oplysninger, der kan yderligere valideret af downstream analyser.

Vi har for nylig ansat de ovenfor beskrevne metoder til at identificere antiviral forbindelser, der effektivt blokeret infektion af ikke-kappeklædte CVA16⁹. Heri beskrives og diskuteres de detaljerede protokoller, der blev brugt.