Двойные линейки ДНК для изучения механизма транслокации рибосом с однонуклеотидной резолюцией
Summary
Двойной анализ линейки ДНК разработан для определения положения мРНК во время транслокации рибосомы, которая опирается на силы разобщенности сформированных дуплексов ДНК-мРНК. С разрешением одного нуклеотида и возможностью достижения обоих концов мРНК, он может обеспечить механистические идеи для транслокации рибосомы и зондирования других смещений нуклеиновой кислоты.
Abstract
Рибосома транслокации относится к рибосомным движением на мРНК ровно тремя нуклеотидами (nt), который является центральным шагом в синтезе белка. Для изучения его механизма существуют два основных технических требования. Во-первых, это одно-nt резолюции, которые могут решить нормальные транслокации от frameshifting, во время которого рибосома движется по мимо 3 nt. Во-вторых, возможность зондирования как входной, так и выездной стороны мРНК, с тем чтобы выяснить всю картину транслокации. Мы сообщаем о двойном анализе линейки ДНК, который основан на критических силах диссоциации дуплексов ДНК-мРНК, полученных с помощью принудительной спектроскопии намагниченности (FIRMS). С разрешением силы 2-4 pN, двойной ассеид правителя достаточно, чтобы различать различные шаги транслокации. Реализуя длинный связующий на зондирующих ДНА, они могут достичь мРНК на противоположной стороне рибосомы, так что позиция мРНК может быть определена для обеих сторон. Таким образом, двойной правитель асссе однозначно подходит для исследования рибосомы транслокации, и нуклеиновой кислоты движения в целом. Мы показываем репрезентативные результаты, которые указали циклический конформации мРНК и решить нормальную транслокацию от frameshifting.
Introduction
Биомолекулярное смещение является фундаментальным параметром при изучении механизма связанных с ними биологических функций. Одним из конкретных примеров является рибосома транслокации1,2, во время которого рибосома движется ровно на три нуклеотидов (nt) на посланника РНК (мРНК) обычно, и на один, два, или другие числа nt, за исключением трех в случае frameshifting. Таким образом, молекулярная система линейки одно-nt разрешение требуется, чтобы различать различные размеры шага. Более сложной задачей является зондирование рибосомного движения как на входной, так и с выездной сторон. Другими словами, только с двойной системой линейки мы сможем выявить, является ли мРНК плавно резьбой через рибосому, или есть промежуточные шаги, в которых обе стороны имеют различные размеры шагов, ведущих к изродоверженной или зацикленный мРНК конформации внутри Рибосома.
Было разработано несколько методов для решения первой задачи решения различных шагов на выходе из рибосомы (3′ конец мРНК). Двойной анализ luciferase разрешает различные рамки чтения путем измерения соотношений в результате различных белков3,4. Она применима только для 3’конца мРНК и, следовательно, недостаточно, чтобы обеспечить полную картину транслокации. Масс-спектрометрия может анализировать различные фрагменты пептидав результате соответствующих перестановок кода 5. Но он не может точно определить, сколько NT рибосома движется на мРНК. Асса “Печатание на носе” является еще одним распространенным методом, который использует обратную транскрипцию, загрунтоваемую на 3′-дистальном конце, чтобы расшифровать мРНК к рибосоме6. Тем не менее, это не применимо для 5’конца мРНК, который входит в рибосому. Другие методы, в том числе одиночные подходы молекулы и методы флуоресценции7,трудно достичь одно-nt резолюции.
Мы разработали двойной анализ линейки ДНК, который может однозначно определять как входные, так и выходные позиции нераскрытой мРНК в комплексах рибосомы-мРНК. Правитель ДНК-олигомеры ДНК, которые образуют дуплексы определенного количества базовых пар (bp) с мРНК обнаружили рибосомы, независимо от того, какой конец мРНК. Bp номера затем точно выявить рибосомы позиции на мРНК во время транслокации. Номера bp дуплексов определяются их критическими силами диссоциации, полученными от принудительной спектроскопии намагниченной намагниченности (FIRMS)8. При неопределенности сил 2-3 pN, критические силы достаточны для того чтобы предложить разрешение одиночной. Путем снабжать молекулу связующего на правителях дна, стерически препятствовала стороне mRNA ribosome можно прощупать. Таким образом, различные рибосомные перемещения могут быть точно разрешены. Мы успешно показали уникальную зацикленный конформации мРНК в ловушке антибиотиков во время транслокации9, и решены различные рамки чтения, которые сосуществовали на скользкой последовательности мРНК10. В этой статье описаны детали двойного анализа правителя, которые включают в себя подготовку рибосомных комплексов, функционализацию поверхности стеклянных горок, иммобилизацию рибосомных комплексов и их гибридизацию с магнитно помеченным линейкой ДНК молекулы, магнитное обнаружение и анализ силового спектра FIRMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
В нашем двойном правителе, магнитные бусы играют две основные роли. Во-первых, они служат в качестве форс-мажоров, поскольку центробежная сила пропорциональна их плавучей массе. Во-вторых, бусы являются сигнальными носителями, обнаруженными атомным магнитометром, который в настоящее в?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения США (R01GM111452, YW, S.X.). Y. W. признает поддержку фонда Уэлча (E-1721).
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
Referencias
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
