Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

El sistema de motor ocular proporciona un sistema elegante para investigar los mecanismos de orientación de axón. Es relativamente sencillo, que consiste en tres nervios craneales que inervian seis músculos extraoculares (EOM) que mueven el ojo, y el levator palpebrae superioris (LPS) que levanta el párpado. El nervio oculomotor incuba el LPS y cuatro EOM – el oblicuo inferior y los músculos medial, inferior, y superior recto. Los otros dos nervios, el trochlear y los abducens, cada uno de ellos sólo inervate un músculo, el músculo oblicuo superior y el músculo recto lateral, respectivamente. Los movimientos oculares proporcionan una lectura fácil, que muestra si la inervación era apropiada, faltaba o era aberrante. Además, hay trastornos del movimiento ocular humano que resultan de déficits en el desarrollo neuronal o guía de axón, colectivamente llamados los trastornos congénitos de disinnervación craneal (CCDD)¹.

A pesar de estas ventajas, el sistema motor ocular rara vez se utiliza en los estudios de orientación de axón^{2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10}, debido a inconvenientes técnicos. Los ensayos de orientación axón in vitro tienen muchas desventajas¹¹. Los ensayos de cocultivo, en los que los explantes neuronales se cultivan junto con explantas de tejido objetivo¹² o células transfectóte^13,dependen tanto de la simetría del explantar como del posicionamiento preciso entre el tejido explanteo y el tejido diana. Ensayos de rayas^14,15, en los que se establecen dos señales en franjas alternas y los axones se evalúan para un crecimiento preferencial en una franja, sólo indican que un sustrato es preferible al otro, no que cualquiera de los dos sea atractivo repulsivo, o fisiológicamente relevante. Las cámaras de microfluidos pueden formar gradientes químicos precisos, pero sujeto a axones en crecimiento a tensión de cizallamiento^16,17,18, que pueden afectar su crecimiento. Además, en cada uno de estos enfoques, la recolección de explantas o células disociadas requiere que los axons de crecimiento superior sean axotomizados y, por lo tanto, estos ensayos examinan realmente la regeneración de axón, en lugar del crecimiento inicial del axón. Por último, estos enfoques in vitro eliminan el microambiente que influye en los axones y sus respuestas a las señales a lo largo de diferentes puntos de su curso, y tradicionalmente sólo prueban una señal de forma aislada. Al componer estas desventajas, el pequeño tamaño de cada núcleo en el sistema motor ocular hace que la disección sea técnicamente difícil para explantas o cultivos disociados. Además, los cultivos primarios de las neuronas motoras oculares suelen ser heterogéneos, tienen muerte celular significativa y dependen de la densidad, lo que requiere la agrupación de células de múltiples embriones (Ryosuki Fujiki, comunicación personal). Los métodos in vivo, sin embargo, incluyendo modelos de ratón knockout, son inapropiados para su uso para la detección, dado el tiempo y los gastos requeridos.

Los métodos desarrollados para cultivar embriones enteros¹⁹ permiten el etiquetado de células migratorias²⁰ o bloqueo de moléculas específicas^21,pero los cultivos de embriones enteros requieren incubación en botellas de rodillos que impide la toma de imágenes en tiempo real de las etiquetas Estructuras. También son posibles las técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación del embrión y luego el posterior desarrollo posterior, ya sea en el útero o en el abdomen de la madre (manteniendo la conexión placentaria)^22, pero tampoco permiten lapso de tiempo Imagen.

Para superar los obstáculos de los ensayos in vitro y permitir un cribado rápido de las vías de señalización, se desarrolló una técnica de cultivo de rodajas embrionarias ex vivo^23,adaptada de un protocolo previamente publicado para el crecimiento del nervio periférico^24. Usando este protocolo, el nervio oculomotor en desarrollo se puede imaginar con el tiempo en presencia de muchas de las estructuras circundantes a lo largo de su trayectoria, incluyendo objetivos de la MOE. Mediante la adición de inhibidores de moléculas pequeñas, factores de crecimiento o señales de orientación a los medios de cultivo, podemos evaluar perturbaciones de orientación en múltiples puntos a lo largo de la trayectoria del axón, permitiendo una evaluación más rápida del crecimiento potencial y los factores de orientación.