Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Das Augenmotorsystem bietet ein elegantes System zur Untersuchung von Axon-Führungsmechanismen. Es ist relativ unkompliziert, bestehend aus drei Hirnnerven, die sechs extraokulare Muskeln (EOMs) innervieren, die das Auge bewegen, und dem Levator palpebrae superioris (LPS), der das Augenlid hebt. Der okulomotorische Nerv innerviert die LPS und vier EOMs – die unterlegene Schräglage und die mediale, minderwertige und überlegene Rectusmuskulatur. Die anderen beiden Nerven, die Trochlea und abducens, jeder nur innervate einen Muskel, die überlegene schräge und seitliche Rectus-Muskel, jeweils. Augenbewegungen bieten eine einfache Anzeige, zeigt, ob Innervation angemessen, fehlt oder abwegig war. Darüber hinaus gibt es menschliche Augenbewegungsstörungen, die aus Defiziten in der neuronalen Entwicklung oder Axonführung resultieren, kollektiv als die angeborenen Schädel-Disinnervationsstörungen (CCDDs)¹bezeichnet.

Trotz dieser Vorteile wird das Augenmotorsystem selten in Axon-Leitstudien 2 ,^3,4,^{5,6,7,8, 9 , 10}, aufgrund technischer Nachteile. In-vitro-Axon-Leitlinien-Assays haben viele Nachteile¹¹. Co-Kultur-Assays, bei denen neuronale Explanten zusammen mit Explanten des Zielgewebes¹² oder transfizierter Zellen¹³kultiviert werden, hängen sowohl von der Symmetrie des Explantations- als auch der präzisen Positionierung zwischen Explantation und Zielgewebe ab. Streifenassays^14,15, in denen zwei Hinweise in abwechselnden Streifen und Axonen auf bevorzugtes Wachstum auf einem Streifen festgelegt sind, deuten nur darauf hin, dass ein Substrat dem anderen vorzuziehen ist, nicht, dass beide attraktiv sind. abstoßend oder physiologisch relevant. Mikrofluidikkammern können präzise chemische Gradienten bilden, aber wachsende Axone der Scherspannung^16,17,18, unterziehen, die ihr Wachstum beeinflussen können. Darüber hinaus erfordert das Sammeln von Explanten oder dissoziierten Zellen bei jedem dieser Ansätze, dass auswachsende Axone axotomisiert werden, und daher untersuchen diese Assays tatsächlich die Axonregeneration und nicht das anfängliche Axonwachstum. Schließlich entfernen diese In-vitro-Ansätze die Mikroumgebung, die Axone und ihre Reaktionen auf Hinweise entlang verschiedener Punkte ihres Kurses beeinflusst, und testen traditionell nur einen Hinweis isoliert. Zusammen mit diesen Nachteilen stellt die geringe Größe jedes Kerns im Augenmotorsystem die Zerlegung für Explanten oder dissoziierte Kulturen technisch eine Herausforderung dar. Darüber hinaus sind Primärkulturen von okularen motorischen Neuronen in der Regel heterogen, haben einen signifikanten Zelltod und sind dichteabhängig, was eine Zusammenlegung von Zellen aus mehreren Embryonen erfordert (Ryosuki Fujiki, persönliche Kommunikation). In-vivo-Methoden, einschließlich Knockout-Maus-Modelle, sind jedoch angesichts der Zeit und des Erforderlichen für das Screening ungeeignet für das Screening.

Methoden, die entwickelt wurden, um ganze Embryonen zu kultivieren¹⁹ ermöglichen die Kennzeichnung von wandernden Zellen²⁰ oder die Blockade bestimmter Moleküle²¹, aber ganze Embryokulturen erfordern eine Inkubation in Rollenflaschen, was eine Echtzeit-Bildgebung von markierten Strukturen. Chirurgische Techniken, die eine Manipulation des Embryos und anschließende Weiterentwicklung entweder in der Gebärmutter oder im Bauch der Mutter (Aufrechterhaltung der Plazentaverbindung)²² ermöglichen, erlauben aber auch keinen Zeitraffer Imaging.

Um die Hindernisse von In-vitro-Assays zu überwinden und ein schnelles Screening von Signalwegen zu ermöglichen, wurde eine ex vivo embryonale Scheibenkulturtechnik entwickelt²³, angepasst an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für peripheres Nervenwachstum²⁴. Mit diesem Protokoll kann der sich entwickelnde okulomotorische Nerv im Laufe der Zeit in Gegenwart vieler der umgebenden Strukturen entlang seiner Flugbahn abgebildet werden, einschließlich EOM-Ziele. Durch Hinzufügen kleiner Molekülinhibitoren, Wachstumsfaktoren oder Leitfäden zu den Kulturmedien können wir Die Orientierungsstörungen an mehreren Punkten entlang des Axonverlaufs bewerten und so eine schnellere Bewertung potenzieller Wachstums- und Orientierungsfaktoren ermöglichen.