JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Published: July 15, 2019
doi:
10.3791/59906
, , , ,
1Aurora Research Institute,Advocate Aurora Health Care, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Science,University of Wisconsin-Milwaukee, 3Department of Medicine-Cardiovascular, School of Medicine,Johns Hopkins University

Summary

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Abstract

Cardiale veiligheids screening is van het allergrootste belang voor de opsporing van geneesmiddelen en Therapeutics. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe high-throughput elektrofysiologische benaderingen voor de hipsc-afgeleide hartspier (hipsc-cm) preparaten veel nodig voor het efficiënt testen van medicijnen. Hoewel multi-elektrode arrays (mea’s) vaak worden gebruikt voor veld potentiaal metingen van prikkelbaar Cells, is een recente publicatie van Joshi-Mukherjee en collega’s beschreven en gevalideerd haar aanvraag voor terugkerende actiepotentiaal (AP) opnames van dezelfde hiPSC-CM voorbereiding over dagen. Het doel hier is om gedetailleerde stapsgewijze methoden te bieden voor het zaaien van CMs en voor het meten van AP-golfvormen via elektroporation met hoge precisie en een temporele resolutie van 1 μs. Deze aanpak behandelt het gebrek aan gebruiksvriendelijke methodologie om intracellulaire toegang te krijgen voor AP-metingen met hoge doorvoer voor betrouwbare elektrofysiologische onderzoeken. Een gedetailleerde werkstroom en methoden voor het bekleden van hiPSC-CMs op multi well MEA Plates worden besproken met nadruk op kritische stappen waar relevant. Bovendien wordt een op maat gemaakt MATLAB-script voor snelle gegevensverwerking,-extractie en-analyse gerapporteerd voor uitgebreid onderzoek van de golfvorm analyse om subtiele verschillen in morfologie te kwantificeren voor verschillende AP-duur parameters die betrokken zijn bij aritmie en cardiotoxiciteit.

Introduction

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hipsc-CMs) zijn de gouden standaard voor een toenemend aantal laboratoria1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Embryoïde lichamen verslaan11,12,13 en monolaag3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differentiatie zijn de voorkeurs methoden voor de productie van cardiomyocyten en de multi-elektrode array (MEA) is uitgegroeid tot een gemeenschappelijke modaliteit voor het monitoren van de elektrodynamica van deze netwerken18,19,20. Terwijl parameters die kunnen worden geëxtraheerd uit het veld mogelijkheden (fps) zoals kloppen rate, amplitude, duur en RR intervallen zijn Baseline elektrofysiologische reacties van spontaan het verslaan van monolagen18,21, 22,23, de actiepotentiaal (AP) componenten die aan deze extracellulaire FP-signalen liggen, zijn moeilijk te extrapoleren24. Onze recente publicatie over de ontdekking van een toepassing van Mea’s voor directe terugkerende AP-metingen biedt een bewijs van methodologie voor voorbeeldige intracellulaire AP-uitlezingen met een uitgebreide golfvorm analyse bij verschillende repolarisatie fases over meerdere partijen hipsc-afgeleide hartspier netwerken3. In de studie hebben we aangetoond dat de levering van elektroporerende pulsen naar netwerken van door hiPSC afgeleide cardio myocytes intracellulaire toegang voor AP-opnames mogelijk maakt. Deze transiënte AP-opnames zijn afhankelijk van mogelijke terugvindingen van transmembraan die worden waargenomen via de schade plaats3,25,26. Golfvormen opgenomen via MEA en patch-Clamp in onze studie toonden vergelijkbare AP-morfologieën waardoor de betrouwbaarheid van de approach3wordt valide.

Een paar laboratoria hebben gerapporteerd het meten van APS uit verschillende elektrogene cellen met behulp van op maat gemaakte meas18,21,26,27,28,29, 30, maar de betrouwbaarheid van het gebruik van Mea’s voor consistente en terugkerende AP-metingen werd niet beoordeeld. Momenteel is de Gold Standard Patch-clamp techniek beperkt tot Terminal opnames7,31 terwijl, op mea gebaseerde AP-metingen van voorbijgaande aard zijn en daarom meerdere malen op dezelfde cel kunnen worden uitgevoerd. We laten ook zien dat men gemakkelijk AP-signalen van hoge kwaliteit kan opnemen in het millivolt-bereik dat minimale filtering vereist. Onderzoekers kunnen daarom niet alleen acute, maar ook chronische geneesmiddelen studies uitvoeren in dezelfde preparaten die Mea’s gebruiken. Bovendien maakt deze technologie gelijktijdige FP/AP-meting het mogelijk om in korte tijd Electro-Biome-bibliotheken te genereren. Gezien de toenemende nadruk op aritmie voorspelling en drug geassocieerde cardiotoxiciteit24,32,33,34,35, integratie van AP-meting benaderingen zullen de beoordeling van de geneesmiddelen veiligheid en de werkzaamheid verbeteren.

Hier presenteren we protocollen voor 1) pre-plating van cryopreserved hiPSC-CMs voor rijping, 2) dissociatie en plating van hiPSC-CMs op multi well MEAs, 3) opname van FPs en APs van hiPSC-CM Networks, 4) segmenteren en extraheren van de gegevens voor analyse, en 5) het herstellen van de arrays voor meervoudig hergebruik. Elke stap is geoptimaliseerd met nadruk op kritieke stappen waar relevant. Eisen voor celbevestiging om te zorgen voor een kloppende syncytiële monolaag worden besproken en procedures voor multi well mea restauratie voor repetitieve elektrofysiologische studies worden uitgelegd. Ten slotte wordt een aangepaste GUI ontwikkeld in het laboratorium gepresenteerd voor AP-signaal extractie, kwaliteitsborging en segmenterings werkstroom om AP-parameters te kwantificeren en te analyseren.

Protocol

1. voorbereiding van oplossingen en materialen (zie tabel van de materialen) 6-goed weefsel-cultuur plaat substraat-coating Het coating substraat op ijs of bij 4 °C ontdooien. Bereid een 1:100 coating substraat verdunning in koude DMEM/F12 medium. Meng de oplossing door langzame pipetteren. Breng 2 mL van de coating substraat oplossing (stap 1.1.2) per put van een 6-goed weefselcultuur plaat. Plaats de gecoate weefselkweek plaat onmiddellijk in de celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 7 uur en gebruik deze binnen 7 dagen. hiPSC-CM kweekmedium Voeg 10 mL CM Media supplement ontdooid bij 4 °C tot 500 mL basismedium. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken. Aliquot vereiste hoeveelheid media voor de dag en op kamertemperatuur brengen voor gebruik. de hipsc-cm ontdooien medium: bereid het verse door het kweken van hipsc-cm kweekmedium (stap 1,2) met 10% foetaal runderserum (FBS). Breng de media op kamertemperatuur voordat u CMs ontdooit voor suspensie. Fibronectin 1 mg/mL stamoplossing: aliquot 200 μL in 1,5 mL steriele microfugebuis buizen en opgeslagen bij 4 °C voor later gebruik. Bereid werkoplossing van 50 μg/mL concentratie vers op ijs. Multi well Cleaning Solution: Combineer 0,5 g enzymatische reinigingsmiddel met 50 mL steriel dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Vortex om de inhoud te mengen. Filter en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal een week. 2. voorbeplating van cryopreserved hiPSC-CM voor rijping (figuur 1) Opmerking: deze sectie is bedoeld voor het ontdooien en kweken van hipsc-CMs dat gedifferentieerd is met de feeder-Free monolaag methode3,16 en cryopreserved in vloeibare stikstof 10 dagen na differentiatie bij 1-2 miljoen cellen/injectieflacon. Cellen uit één injectieflacon worden in twee putten met substraat coating van een 6-Wells weefselkweek plaat geplateerd. Cardiomyocyten hebben de neiging om zich te vestigen op de bodem van de buis, zodat Zacht mengen op het moment van pre-plating is belangrijk voor het bereiken van gelijkmatige celdichtheid over putten. Aliquot 2 mL FBS per injectieflacon hiPSC-CMs ontdooid in een conische buis van 15 mL en op kamertemperatuur brengen. Ontdooien injectieflacons met cryopreserved hiPSC-CMs door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen en zachtjes te zwenken voor zelfs ontdooien gedurende niet meer dan 3 minuten. Breng de inhoud van de injectieflacon onmiddellijk over naar de buis met FBS (zie stap 2,1), Meng door wervelend en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Aspireren de supernatant en rediëren van de celpellet in 1 mL hiPSC-CM ontdooien medium (zie stap 1,3) per injectieflacon ontdooid. Gebruik een pipet om de pellet door zachte trituratie te hervatten. Evalueer de levensvatbaarheid van de cel. Voeg extra 3 mL ontdooien per injectieflacon hiPSC-CM ontdooid in stap 2,4 en onderbreek zachtjes met behulp van een transferpipet om celklonters verder te ontkoppelen. Doseer 2 mL celsuspensie zachtjes in elke put van 6-well platen met substraat coating (zie stap 1,1). Plaats in de celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2. Vervang met verse hiPSC-CM kweekmedium na 24 h en 3 keer per week gedurende 20 dagen.Opmerking: cellen moeten 24 uur per dag aan de substraat coating voldoen en spontaan op 48 h na het plating kloppen (Zie Video 1 en video 2). 3. multi well MEA plaat sterilisatie en coating (figuur 2 en figuur 3) Opmerking: het hier beschreven protocol is voor het bereiden van 24-Well MEA platen met 12 micro Gold PEDOT gecoate elektroden op glas voor het beplating van hiPSC-CM. Vermijd het aanraken van de bodem van de plaat, omdat dit de elektroden kan beschadigen. Voeg twee dagen vóór het beplating van de cel 0,5 mL hiPSC-CM kweekmedium (zie stap 1,2) toe aan elk goed en voer een basislijn opname uit om de signaal-ruis verhouding voor de kwaliteitscontrole van de Mea’s te controleren. Aspireren van de media, spoelen met steriele ddH2O en steriliseren onder UV-licht in een laminaire flow kap ‘s nachts. De dag voorafgaand aan celplating, toevoegen 0,1 mL FBS aan elk goed voor hydrofiele behandeling van MEA oppervlakken. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Deze stap is nodig voor de celbijlage. Zuig de FBS op en spoel af met 0,5 mL steriele ddH2O per put. Herhaal nog een keer. Laat de plaat ‘s nachts drogen in de laminaire flow Hood. Bereid een werkverdunning van 50 μg/mL fibronectin in koud DMEM/F12 medium uit de voorraad (zie stap 1,4). Houd de oplossing op ijs. Pipetteer 5 μL van de werkende fibronectine verdunning (zie 3,6) en verdeel de druppel voorzichtig naar het midden van elk goed om alle 12 elektroden te bedekken. Het is belangrijk om snel over de 24 putjes te werken om te voorkomen dat de druppel uitdroogt. Plaats de met fibronectin gecoate multi well MEA plaat onmiddellijk op een verhoogd oppervlak in een bevochtigend kamer met steriele ddH2O om het gehele vaat oppervlak te bedekken. Plaats de kamer met de multi well MEA Plate voor 3 uur in de celkweek incubator.Opmerking: het plaatsen van de 24 Well MEA plaat in een bevochtigende kamer is van cruciaal belang om te voorkomen dat fibronectin druppeltjes uitdrogen tijdens de incubatieperiode. 4. hiPSC-CM dissociatie en beplating op multi well MEA plaat (figuur 3) Opmerking: start deze stap ongeveer 1 uur vóór de incubatie van MEA fibronectin is voltooid. Zorg ervoor dat de oplossing voor celdissociatie bij 37 °C ligt en dat het ontdooien van het iPSC-CM-medium op kamertemperatuur is. Dissociatie methoden zijn geoptimaliseerd voor 30 dagen na gedifferentieerd hiPSC-CMs gekweekt op substraat-gecoate 6-well platen (zie stap 2) om ongeveer 90% levensvatbare CMs voor MEA plating te verkrijgen. Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd tijdens de trituratie om celdood te voorkomen. Aspirate het cultuurmedium van elke put van de 6-well weefselcultuur schotel met 30 dag post-gedifferentieerde hiPSC-CM cultuur (zie stap 2,7) en was met 2 mL steriele D-PBS per put. Voeg 1 mL voorverwarmde celdissociatie oplossing (Zie tabel met materialen) per put toe en inbroed gedurende 4 minuten bij 37 °c. Gebruik een pipet om voorzichtig te tritureren om de cellen los te maken voor dissociatie. Als de meeste cellen nog steeds aanhandig zijn, inbroed dan nog eens 3 min bij 37 °c en weer wrijf. Deze extra incubatie moet helpen bij het maximale celherstel. Niet inbrokkelen gedurende meer dan 7 minuten, omdat dit kan resulteren in een lage levensvatbaarheid van de cel. Gebruik een pipet voor het overbrengen van alle gezien cellen in een conische buis die hipsc-cm ontdooien medium bevat (zie stap 1,3). Het wordt aanbevolen om de cellen in ten minste tweemaal het volume van de media (2 mL per goed worden geoogst) op te schorten om de activiteit van de cel dissociatie oplossing te blokkeren. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Zuig de oplossing zorgvuldig op omdat de pellet losjes aan het oppervlak is bevestigd en respendeert in 0,1 ml van hipsc-cm ontdooien medium. Gebruik een pipet om de pellet een paar keer te hervatten door zachtjes te trituratie. 2 μl gezien cellen en Verdun met 18 μl media in een 1,5 ml microfugebuis buis. Voeg 20 μL Trypaan blauw toe en meng voor het aantal cellen en de beoordeling van de levensvatbaarheid. Stel de celdichtheid in op 6.000 cellen/μL door het juiste volume van het hiPSC-CM ontdooien medium toe te voegen. Onderbreek de pellet door een paar keer zachtjes te flikken. Het hiPSC-CMs is gemakkelijk los te koppelen van glazen oppervlakken, vooral wanneer het wordt geplateerd bij hoge dichtheden. We hebben de zaaien dichtheid en plating voorwaarden om te bereiken 15 dagen van elektrische opnames geoptimaliseerd. Wanneer u klaar bent, breng de multi well MEA plaat in de laminaire flow kap voor het zaaien van cellen. Het is van cruciaal belang om de volgende twee stappen een goed op een tijdstip uit te voeren om te voorkomen dat de fibronectin wordt gedroogd. Verwijder voorzichtig de fibronectin druppel met een P10 pipet zonder de elektroden aan te raken. Verdeel onmiddellijk een 5 μL celdruppel (30.000 cellen) in het midden van de put van de MEA plaat die alle 12 elektroden beslaat. Herhaal de stap tot alle 24 putten zijn verguld. Intermitterende menging van celsuspensie door al vegend wordt aanbevolen. Plaats de multi well MEA plaat terug in de losjes bedekte bevochtigend kamer en keer terug naar de celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 3 uur voor celbevestiging. Voeg voorzichtig 200 μL hipsc-cm ontdooien medium toe aan elk goed zonder de cellen te storen met een P200 pipet. Voeg de media druppelsgewijs toe aan de zijkant van de put. Plaats de multi well MEA plaat terug in de celkweek incubator. Vervang met een verse hiPSC-CM kweekmedium op 24 uur na het beplating. Op dit moment kan het spontaan verslaan van cardiomyocyten worden waargenomen (Zie Video 3). Verander de media elke 2 dagen tot het einde van de experimenten. 5. hiPSC-CM elektroporation en signaal verwerving (figuren 4 – 6) Opmerking: dit protocol is voor gelijktijdige opname van high-throughput elektrode signalen (12 locaties voor elk van de 24 Wells). Het 24-Well multi well MEA systeem wordt gebruikt met de acquisitie software (Zie tabel met materialen). Alle MEA opnames worden uitgevoerd bij 37 °C. Schakel het interface bord in en start de acquisitie software. Geef voldoende tijd voor de hoofdfase van de multi well MEA om de temperatuur van 37 °C te bereiken (zie pijl nummer 1 in Figuur 4). Plaats multi well MEA Plate van stap 4 in de hoofdfase van de multi well MEA door deze over het opname platform te plaatsen en klik op de knop bijvoegsel (zie pijl nummer 2 in Figuur 4). Laat de temperatuur stabiliseren voordat de opnames worden gestart. Instellingen voor acquisitie en elektroporation aanpassen Klik op het pictogram experimentele stroom definiëren (zie pijl nr. 3 in Figuur 4) en stel de opnametijd in op 2 min of naar wens. Klik op het pictogram voor het instellen van gegevensverwerving (zie pijl nr. 4 in Figuur 4) en stel samplefrequentie in op 20 kHz, hoogdoorlaatfilter tot 0,1 Hz en low-pass filter tot 3500 Hz. Klik op het pictogram stimulator-instellingen (Zie afbeelding 5). Definieer onder het tabblad stimulus-definitie stimulatie als bifasische symmetrische Spanningspulsen van 1 mV, 1 MS en 1 Hz. Onder de stimulatie elektroden tab, selecteer electroporatie sites door het markeren van alle relevante elektroden. Klik op de knop verkennen om signalen in alle putjes te visualiseren. Controleer de signaalkwaliteit en de steady state condities. Maak aantekeningen op elektroden met FP-signalen in het mV-bereik. Klik op dezelfde knop om de verkenning te stoppen. Tot op dit moment zijn er geen gegevens geregistreerd. Start de opname door op de Go! -knop te klikken. De elektroden in elke put zullen FP-signalen tonen in het venster onbewerkte gegevens (Figuur 6). Na 30 s van de opname, klik op de knop stimuleren en laat elektroporation plaatsvinden op de geselecteerde sites voor 30 s; Klik vervolgens op dezelfde knop om stimulatie te stoppen en door te gaan met opnemen voor de resterende 60 s.Opmerking: het opgenomen bestand kan worden afgespeeld door over te schakelen naar ‘ Replayer mode ‘ in het vervolgkeuzemenu ‘ toepassing ‘. 6. multi well MEA plaat reiniging voor hergebruik Reinig na de laatste experimenten alle putjes in de multi well plate door alle media-inhoud van elk putje te zuigen en het elektrode oppervlak voorzichtig te vermijden. Voeg 1 mL steriele ddH2O per put toe. Aspirate en herhaal één keer. Voeg toe 0,3 mL multi well reinigingsoplossing (zie stap 1,5) per put. Incuberen ‘s nachts op kamertemperatuur om cellen en puin te verdrijven. Zuig de volgende ochtend de oplossing op en spoel met 1 ml steriele DDH2O. inincuberen gedurende 5-7 min en aspiraat. Herhaal dit 5 keer. Voeg 0,5 mL steriele ddH2O per put toe. Noteer de basislijn van de gereinigde multi well-plaat voor de kwaliteitscontrole van de gereinigde Mea’s (Figuur 7). Bewaren bij 4 °C tot het klaar is voor gebruik. 7. conversie en export van gegevensbestanden Opmerking: er worden vier gegevensbestanden gegenereerd voor elke opname: MWR-, MWC-, MWD-en MWS-bestanden. Met behulp van de conversie software kan het MWD-bestand worden geconverteerd naar het H5-bestand voor daaropvolgende analyse met behulp van een op maat gemaakt script (Zie aanvullend bestand 1). Start de conversie software (Zie tabel met materialen). Selecteer invoerpad instellen in het menu bestand . Selecteer map met gegevensbestanden van belang. Selecteer uitvoerpad instellen in het menu bestand . Selecteer de map waarin geconverteerde bestanden moeten worden opgeslagen. Markeer het MWD-bestand met interesse. Klik op de knop exporteren naar hdf5 . 8. segmentatie en analyse van gegevens (cijfers 8-10) Opmerking: op MATLAB gebaseerde aangepaste software wordt gebruikt om verschillende FP-en AP-gegevens parameters te segmenteren en te extraheren. Software is beschikbaar op aanvraag. Voer de Waveform-analyse code uit met MATLAB (Zie afbeelding 8 voor een weergave van het hoofdvenster van de GUI). Klik op bestand en selecteer process. H5. Zoek en selecteer het bestand mwd. H5 dat is gemaakt volgens stap 7 hierboven. Klik op de knop Save Directory om de opslaglocatie van de uitvoerbestanden te wijzigen. Maak een signaalverwerking wachtrij door te selecteren elektrode/well combinaties van belang en klik vervolgens op de wachtrij knop. Herhaal deze stap om meer elektrode/well-combinaties toe te voegen die naar de wachtrij worden verwerkt. Bewerk de wachtrij door direct op med-naam/med-concentratie te klikken als cellen werden behandeld met drugs (Figuur 8). Zodra de wachtrij definitief is, klikt u op de knop waveforms initialiseren . Hiermee start u de voorbereidende verwerking waarin signalen worden geïdentificeerd en geëxtraheerd voor segmentatie. Klik op de knop Inzoomen en selecteer het actiepotentiaal gebied met de cursor (afbeelding 9). Klik op de knop Keep en Bekijk de deelvensters. Pieken (rode ‘ x ‘) en troggen (gele cirkels) worden gedetecteerd voor elke golfvorm en de genormaliseerde actie potentialen worden bovenop. Klik op de knop Keep en ga verder met de volgende tracering in de wachtrij (afbeelding 10). Herhaal stap 8.8-8.9 voor de rest van de elektrode/well-combinatie signalen in de wachtrij.Opmerking: er wordt een . CSV -bestand gegenereerd met apd-parameters die worden gemeten voor elke golfvorm. Een . mat -bestand voor elk . H5 -bestand wordt ook opgeslagen om extra verwerking van gesegmenteerde gegevens toe te staan.

Representative Results

De levensvatbaarheid en plating dichtheid van post-ontdooide hiPSC-CMs is van cruciaal belang voor de multi well MEA cultuur. Pre-plating van 1-2 miljoen hipsc-CMs/Vial in twee putten van een 6-Wells weefselkweek plaat met 50% of meer levensvatbaarheid zal een gezonde monolaag cultuur produceren met spontaan verslaan op 48 h. slechte levensvatbaarheid van CMs zal resulteren in culturen met een hoog percentage van niet-Myocyte populaties. Deze monolagen bij gezien voor multi well mea plating produceren in het algemeen inconsistente resultaten en slechte kwaliteits signalen en moeten daarom worden weggegooid. Figuur 1 toont voorbeelden van optimale versus suboptimale hipsc-CMs culturen op 48 h post plating. Het ontdooien van het CMs op substraat gecoate weefselkweek platen in plaats van direct op multi well MEAs, zorgt voor celherstel en rijping3. Directe beplating van cryopreserved CMs op de array wordt niet aanbevolen omdat het inconsistente resultaten produceerde. Naast de kwaliteit van het gedissocieerde CMs is de celhechting op de multi well MEA sterk afhankelijk van de celdichtheid en de fibronectin coating techniek. De grootte van de fibronectin-druppel is essentieel omdat het CMs voldoet aan de grenzen van het gebied met fibronectine-coating. Om deze reden wordt slechts 5 μL van de fibronectin-oplossing direct over het elektrode-array gebied afgeleverd. Om ervoor te zorgen dat de druppel niet dispergeren, moet het goed oppervlak volledig droog zijn op het moment van coating. Figuur 2 toont de lay-out van de multi well mea plaat met schema’s van stap-voor-stap voor behandeling voor optimale voorbereiding. Om te voorkomen dat de fibronectin wordt gedroogd, moeten de multi well MEA platen in een bevochtigende kamer worden geplaatst gedurende de incubatieperiode van niet meer dan 3 uur (zie stap 3,8). Zodra de incubatieperiode is voltooid, is het belangrijk om de fibronectin druppel van elk goed te verwijderen vlak voor het beplating van de cm en pas vervolgens door te gaan naar volgende goed beplating. Snel en zorgvuldig doseren van het CMs is de sleutel tot een succesvolle celbevestiging. hiPSC-CM culturen op 30 dagen na differentiatie worden losgekoppeld voor multi well MEA plating met behulp van de enzymatische celdissociatie methode (zie stap 4). CMs zal met 3 uur aan de op fibronectin gecoate mea-oppervlakken worden bevestigd en een monolaag die de arrays beslaat, zal zichtbaar zijn na 24 uur na het beplating (Figuur 3). Synchrone kloppen van de monolaag zal worden waargenomen bij 24-48 h. de dispersie van de celdruppel beïnvloedt de cultuur dichtheid of leidt zelfs tot drogen en celdood. Nauwkeurige plaatsing van de cel direct op de array is van het allergrootste belang en daarom moet de techniek worden beoefend voor optimale beplating. Celadhesie aan de referentie-elektrode zal de productie van elektrische signalen belemmeren. Zie afbeelding 3 voor afbeeldingen van optimale plaatsing van cm en cultuur na 24 uur. Het CMs gecultiveerde op multi well MEAs worden onderworpen aan kwaliteitscontrole voor elektrische activiteit bij 48 h na het beplating. Doorgaans neemt de amplitude van het FP-signaal toe van het μV-bereik naar mV in ongeveer 4 dagen3. Als 50% van de elektroden binnen een netwerk en 70% van de totale netwerken niet FP-signalen produceren, dan is het netwerk of de cultuur suboptimaal en moet worden weggegooid. Alleen culturen die de kwaliteitscontrole doorstaan, worden verwerkt voor FP-en AP-analyse. Figuur 6 toont voorbeelden van goede en sub-standaard FP-signalen. Elektroporation-gemedieerde AP-opnames kunnen meerdere malen worden verkregen uit culturen 48 h na-MEA plating. Met Electroporation hebben we intracellulaire toegang tot het opnemen van High-Resolution APS van meerdere door hipsc afgeleide hartspier-netwerken opgedaan. Laagspannings pulsen (1 V, 1 MS, 1 Hz) voor 30 s werden geleverd voor voorbijgaande, omkeerbare transformatie van FP naar AP. De elektroporation zorgt voor een succesvolle intracellulaire toegang voor AP-meting in ongeveer 75% van de elektroden. Elektrische signalen worden geregistreerd voor 2 minuten met 30 s pre-elektroporation, 30 s tijdens en 1 min post-Electroporation. Een trein van 10 s AP golfvormen 10 s post-Electroporation worden geëvalueerd op alle locaties voor signaalkwaliteit en analyse. Elke tracering die niet aan het zuivere AP-signaal voldoet, wordt genegeerd. Om te onderzoeken of AP amplitudes correleren met FP signaal we elektroporated alle 288 sites om gelijktijdig te registreren golfvormen. Representatieve FP-en AP-signalen die vanuit dezelfde cellocatie van twee verschillende elektroden zijn opgenomen, worden weergegeven in figuur 11a. We waargenomen geen correlatie tussen FP amplitudes en post electroporatie AP amplitudes opgenomen van dezelfde cel site. Bovendien hadden meerdere elektroporaties van dezelfde cellocatie op 0, 24, 48, 72 en 96 h na verloop van tijd geen significant effect op de AP-vorm (figuur 11B). Gezien de hoge doorvoersnelheid van het systeem is een handmatige techniek om parameters van belang te extraheren en te kwantificeren, zoals RR-interval, momentane frequentie en differentiële actiepotentiaal duur, inefficiënt en tijdrovend. Een op maat gemaakt MATLAB-script dat op verzoek beschikbaar is voor de onderzoeksgemeenschap, wordt gebruikt om golfvorm metingen uit te voeren met een resolutie van 1 μs. Elektroporation tijdpunten worden met het geëxtraheerde signaal overgelegd om 10 s van AP post-Electroporation te identificeren om signaal extractie, kwaliteitsborging en segmentatie workflow uit te voeren (Figuur 8, Figuur 9, figuur 10). de gebruikersinterface maakt het mogelijk om het gewenste segment te selecteren met behulp van de overlegde elektroporation indicatoren als leidraad. De gesegmenteerde golfvorm wordt verwerkt door subroutines om individuele AP-golfvormen verder te identificeren. Dit wordt voltooid door middel van piek detectie, waarbij voor elke cyclus de hoogste en laagste spanning wordt vastgesteld. Zodra dit proces is voltooid, de amplitudes zijn genormaliseerd, en de koppelen tijd vectoren worden verschoven om te definiëren tijd nul met een piekwaarde van 1. Interpolatie van snijpunten langs de individuele cycli werd gebruikt om APD-metingen te bepalen. Dus, gedeeltelijke automatisering workflow voor AP golfvorm segmentatie maakt efficiënte data-analyse voor verschillende APD parameters over meerdere batches van culturen in een korte periode van tijd. Verdere automatisering van inclusie-en uitsluitingscriteria voor FPs en APs loopt voort voor real-time data-analyse. Een significant voordeel van de multi well MEA Plate is dat het meerdere malen hergebruikt kan worden. Deze restauratie maakt repetitieve elektrofysiologische studies mogelijk voor kosteneffectieve en consistente gegevensverzameling. Opnames van APs uit dezelfde array na 6 restauraties worden weergegeven in afbeelding 12. Signaal-ruis verhouding is vergelijkbaar bij meerdere herhalingen. Om de betrouwbaarheid van de array voor repetitieve elektrofysiologische studies aan te tonen, worden in totaal 3815 AP-golfvormen samengevoegd van drie restauratie batches en worden AP-duur gegevens geëxtraheerd om de reproduceerbaarheid van de resultaten te onderzoeken. Distributie percelen voor individuele golfvorm APD30, apd80, driehoeksmeting (apd80— apd30) en breuk verkorting (apd80— apd30)/(apd80)) worden weergegeven (Figuur 13). Figuur 1: pre-plating van cryopreserved hiPSC-cm voor rijping. A) celverwerking voor pre-plating 1 Injectieflacon van 10 dagen na differentiatie cryopreserved hipsc-CMs. (B) fase contrast beelden van geslaagde (linker) en niet-geslaagde (rechts) hipsc-culturen. Schaal: 275 μm. Zie Video 1 en video 2 voor succesvolle 14 en 24 dagen na differentiatie cultuur voorbeelden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: multi well mea Plate Setup en voorbereiding. A) multi well mea plaat Schema’s: de plaat bestaat uit 24 putjes (a1 tot en met D6) die elk 12 micro-elektrode arrays en 4 perifere referentie-elektroden bevatten. Elektrode diameter: 30 μm/Inter-elektrode afstand: 300 μm. opnames kunnen tegelijkertijd worden verkregen uit de 288 elektroden. B) sterilisatie-en hydrofiele behandelingsstappen die moeten worden uitgevoerd vóór het beplating van hipsc-cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: hiPSC-cm dissociatie en beplating op multi well mea plaat. (A) Schema’s van hipsc-cm mea plating voor elke put. B) microscopisch beeld ter illustratie van de correcte plaatsing van de celdruppel die alle 12 elektroden bestrijkt zonder zich te verspreiden naar de 4 referentie-elektroden. C) fase contrast microscopische beelden van een voorbeeldig (links) en suboptimaal (rechts) hipsc-cm PLATTING op mea bij 24 uur na het beplating. Schaalbalk = 275 μm. Zie Video 3 voor het succesvolle voorbeeld van de mea plating. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: multi well-screen acquisitie software. Pijlen geven de locatie aan van de belangrijkste functies en functies waarnaar in de tekst wordt verwezen: temperatuurregeling (1) paneel zorgt voor real-time temperatuurbewaking tijdens het experiment. Insert/eject (2) knop Engage en laat de multi well MEA Plate los. Definieer experimentele stroom (3) functie stelt de gebruiker in staat om de duur van de opname in te stellen. Met de functie gegevensverzameling instellen (4) kan de gebruiker de instellingen voor de bemonsteringsfrequentie en het acquisitie filter instellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: Hipsc-cm elektroporation en signaal verwerving . Stimulus definition tabblad stelt de gebruiker in staat om de elektroporerende pulsparameters te definiëren. Met het tabblad stimulatie elektroden kan de gebruiker de elektroporerende elektroden selecteren. Elke combinatie van de 288 elektroden kan worden geselecteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 6: kwaliteitscontrole van multi well MEAs voor elektrische activiteit. Multi well-Screen acquisitie software die onbewerkte gegevensvensters weergeeft met representatieve voorbeelden van optimale (a) en sub-standaard (B) FP-signalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Afbeelding 7: fp-en AP-signalen van de nieuwe en herstelde array. Multi well MEA enzymatische reinigingsstappen (A). Het basislijn signaal van de nieuwe array toont een minimale signaal-ruis verhouding (B) en FP-signalen tonen de elektrische activiteit van het netwerk (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 8: gegevens segmentatie en-analyse. Weergave van het hoofdvenster van GUI voor Waveform-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 9: gegevens segmentatie en-analyse. Initialiseer de Wave Forms -knop om AP-golfvormen voor segmentatie te identificeren en uit te pakken en om de voorbereidende verwerking te starten door in te zoomen en het actie potentieel gebied te selecteren. Rode cirkels zijn de elektroporation indicatoren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Afbeelding 10: segmentatie en analyse van gegevens. Pieken (rode ‘ x ‘) en troggen (gele cirkels) worden gedetecteerd voor elke golfvorm en de genormaliseerde APs worden bovenop een kwaliteitscontrole van de golfvormen gelegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Afbeelding 11: AP amplitude afhankelijkheid van het FP-signaal voor meerdere opnames van dezelfde cellocatie. FP amplitude in μV bereiken (a, linksboven paneel) of MV bereiken (a, rechtsboven paneel) opgenomen van twee onafhankelijke elektroden te produceren AP amplitude in MV bereik (a, linker en rechter panelen) tonen geen correlatie tussen FP amplitudes en post-Electroporation AP amplitudes. De genormaliseerde AP-golfvormen voor elke opname worden boven elkaar gelegd, zoals voor elke opname. Meerdere elektroporaties van dezelfde cellocatie bij 0 tot 96 h produceerden hoge kwaliteit AP-golfvormen die het volgen van membraan elektrodynamica mogelijk maken (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Afbeelding 12: AP-opnames na zes restauraties. AP golfvormen gelijktijdig opgenomen 10 s post-Electroporation over 12 elektroden uit dezelfde put worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Afbeelding 13: APD parameter histogrammen van meerdere restauraties. Distributie percelen voor individuele golfvorm apd30 (A), apd80 (B), driehoeksmeting (apd80— apd30) (C) en fractionele verkorting (apd80— apd30)/(apd80)) (D) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullende bestanden. Videos 1-3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In de loop der jaren is de toepassing van meas beperkt tot het uitvoeren van FP-metingen van prikkelbaar cellen om hun elektrofysiologische eigenschappen te bestuderen36,37,38,39. Slechts een paar groepen hebben gerapporteerd AP sporen van elektrogene cellen met behulp van aangepaste mea gebaseerde technologie18,29,30. Deze benaderingen zijn echter niet onderzocht op herhaalde opnames van dezelfde preparaten. We ontwikkelden een innovatieve en accurate methodologie voor het bestuderen van APs van dezelfde cellocatie gedurende dagen in meerdere hiPSC-CM-netwerken tegelijk3. In onze gepubliceerde studie werd een multi well micro-Gold MEA-platform gebruikt om AP Waveform-bibliotheken te genereren uit meerdere batches hiPSC-CM-culturen met hoge precisie en met een temporele resolutie van 1 μs. Het hier beschreven protocol verklaart de zaaien van hipsc-CMs op de array voor een efficiënte ontwikkeling van syncytiële cm-netwerken voor AP-opnames met een hoge doorvoer. Verschillende kritieke stappen in het protocol zijn: 1) productie van meerdere hoge zuiverheids batches van kwaliteitscontrole CMS voor cryopreservatie Banking, 2) zeer levensvatbare post-Thaw CMS voor pre-plating en rijping, 3) behandeling van de multi well mea plaat voor cm Seeding, 4) hiPSC-CM cultuur dissociatie op 30 dagen na differentiatie voor MEA plating, en 5) restauratie van de Mea’s voor meervoudig hergebruik.

Het is belangrijk op te merken dat Batch-to-batch variatie in hiPSC differentiatie invloed kan hebben op experimentele uitkomsten. De monolaag-methode van differentiatie werd in-House geoptimaliseerd voor hoog percentage hartspier productie3,40. De FACS analyse van MLC2v en TNNT2 markers van onze culturen tonen een ≥ 90% ventriculaire-achtige fenotype3. Deze culturen met kwaliteitscontrole zijn cryopgereserveerd voor experimentele studies. De huidige differentiatie benaderingen opleveren een heterogene mix van nodal-, atriale-en ventrikel-achtige cellen3,16,17,41. Daarom kunnen strategieën voor CM-subtype populatie verrijking de specificiteit van de culturen verder verbeteren. Bovendien, weefsel engineering benaderingen kunnen worden gebruikt om hun rijping te verbeteren. De hier voorgestelde methoden kunnen gemakkelijk worden geïmplementeerd voor andere CM-bronnen.

De AP-golfvormen die met mea werden geregistreerd, waren vergelijkbaar met die opgenomen in netwerken van cardiomyocyten door optische toewijzing42,43, aanvullende metaaloxide halfgeleider-gebaseerde mea18,21en gesimuleerde AP met behulp van FP Recordings20. Om het mechanisme van AP-metingen via MEA Hai en Spira25 aan te pakken, is aangetoond dat de elektropore-elektrode-interface de gevestigde Sharp Glass micro elektrode-techniek nabootsen. Het rust membraanpotentiaal en de ware amplitude waarden in ons onderzoek kunnen echter niet worden vastgesteld gezien het feit dat de elektropore-elektrode-interface in MEA Systems niet is gekalibreerd en dat de amplitude een functie is van de gevoeligheid en resolutie van de Techniek. Onze aanpak deelt vergelijkbare beperkingen als optische mapping als het gaat om de amplitude van de AP.

De multi well MEA-based FP/AP-uitlezingen die hier worden gerapporteerd, openen nieuwe mogelijkheden voor beoordeling van de geneesmiddelen veiligheid. Hoewel spontaan, verslaan deze hipsc-cm monolagen een constante snelheid. De analyse van APD-parameters in meerdere netwerken biedt inzicht in de elektrische heterogeniteit (Figuur 13). Uitgebreide APD-restitutie-analyses moeten echter voorafgaande diastolische intervallen omvatten. Bovendien zijn hoogwaardige AP-golfvormen die zijn opgenomen op dezelfde cellocatie boven 96 uur (figuur 11B) het eerste rapport om membraan elektrodynamica in de loop van de tijd te volgen, wat van waarde zal zijn in ontwikkeling en in ziekte.

Het protocol dat hier wordt beschreven voor het kwantificeren van AP-parameters kan worden gebruikt om dosisrespons curven te genereren voor het testen van verbindingen. Zoals onlangs gemeld door Edwards et al.3, worden de dosisrespons van noradrenaline, isoproterenol en E 4031 uitgezet voor apd bij verschillende repolarisatie fasen. De gepubliceerde studie toonde de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de aanpak voor het identificeren van de dosis-afhankelijke subtiele veranderingen in de AP golfvormen in real time. Deze techniek kan gemakkelijk worden uitgebreid voor andere verbindingen of kleine molecuul bibliotheken voor het begrijpen van verschillende elektrofysiologische reacties.

De op MEA gebaseerde benadering voor AP-metingen die in deze studie wordt gepresenteerd, zal niet alleen van belang zijn voor elektrofysiologen, maar ook voor celbiologen en in-silico modelers. Bovendien zullen FP/AP-opnames van dezelfde mobiele site op hipsc-CMs onderzoekers in staat stellen om binnen korte tijd bioelektrische data bibliotheken van een breed scala aan prikkelbaar cellulaire netwerken te genereren. Beschikbaarheid van deze middelen zal waardevol zijn voor drugs ontdekkingen en ziekte modellering.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Geen

Materials

Accutase Sigma Aldrich A6964-100ML cell dissociation solution
Acquisition software Multichannel Systems Multiwell-Screen v 1.9.2.0
B27 Supplement ThermoFisher 17504-044 CM media supplement
Converter software Multichannel Systems MultiChannel DataManager
DMEM/F12 ThermoFisher 11330-032
D-PBS ThermoFisher 14190-250
FBS Fisher Scientific SH3007103HI
Fibronectin Sigma Aldrich F1141-5MG
Geltrex ThermoFisher A1413202 coating substrate
Interface board Multichannel Systems MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board
Multiwell MEA Plate Multichannel Systems 24W300/30G-288
RPMI 1640 ThermoFisher 11875-093 CM base medium
Terg-a-zyme Sigma Aldrich Z273287-1EA enzymatic detergent
Transfer pipettes, individually wrapped Fisher Scientific 1371148
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154-100ML
Ultrapure sterile water ThermoFisher 10977-023
6-well tissue-culture treated plates Fisher Scientific 08-772-1B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
  2. Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
  3. Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  4. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  5. Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
  6. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  7. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
  8. Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
  9. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  10. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  11. Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
  14. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  15. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  16. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  18. Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
  19. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
  20. Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
  21. Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
  22. Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
  23. Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
  24. Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
  25. Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
  26. Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
  27. Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
  28. Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
  29. Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
  30. Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
  31. Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
  32. Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
  33. Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
  34. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
  35. Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  36. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  37. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
  38. Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
  39. Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
  40. Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  41. Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
  42. Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
  43. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).

Tags

Human IPSC-derived CardiomyocytesMultiwell Micro-electrode ArraysAction Potential RecordingsCell PlatingElectrophysiologyMATLAB WorkflowSignal-to-noise RatioFibronectin Coating

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Zlochiver, V., Kroboth, S. L., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings. J. Vis. Exp. (149), e59906, doi:10.3791/59906 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image