شبكات خلايا القلب المستمدة من iPSC البشرية على صفائف متعدد الأقطاب الكهربائية الصغيرة للتسجيلات المحتملة للعمل المتكرر
Summary
تحتوي هذه المقالة على مجموعة من البروتوكولات لتطوير الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية (hiPSC-CM) الشبكات المستزرعة على لوحات MEA متعددة الآبار لقلب غشاء الخلية للعمل القياسات المحتملة. يتم الحصول على تسجيلات عالية الإنتاجية من نفس مواقع الخلايا مرارا وتكرارا على مدى أيام.
Abstract
فحص سلامة القلب ذو أهمية قصوى لاكتشاف المخدرات والعلاج. ولذلك، هناك حاجة ماسة إلى تطوير نهج جديدة عالية الإنتاجية الكهربائية الفسيولوجية لمستحضرات خلايا القلب المستمدة من hiPSC (hiPSC-CM) لاختبار المخدرات بكفاءة. على الرغم من أن صفائف متعددة الأقطاب (MEAs) تستخدم في كثير من الأحيان للقياسات الميدانية المحتملة للخلايا المنفعلة، فإن منشوراً صدر مؤخراً عن جوشي – موخيرجي وزملاؤه وصف وصدق على تطبيقه لتسجيلات إمكانية اتخاذ الإجراءات المتكررة (AP) من نفس إعداد hiPSC-CM على مدى أيام. والهدف هنا هو توفير أساليب مفصلة خطوة بخطوة لبذر CMs وقياس أشكال الموجات AP عن طريق الكهربائي بدقة عالية ودقة زمنية من 1 μs. ويعالج هذا النهج عدم وجود منهجية سهلة الاستخدام للوصول داخل الخلايا إلى قياسات AP عالية الإنتاجية لإجراء تحقيقات كهربائية فسيولوجية موثوقة. وتناقش سير العمل التفصيلي وطرق طلاء hiPSC-CMs على لوحات الشرق الأوسط والإدارة متعددة الآبار مع التركيز على الخطوات الحاسمة حيثما كان ذلك مناسباً. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن سيناريو MATLAB مصمم خصيصًا للمعالجة السريعة للبيانات واستخراجها وتحليلها لإجراء تحقيق شامل في تحليل الموجي لتحديد الاختلافات الدقيقة في المورفولوجيا لمختلف معلمات مدة AP المتورطة في عدم انتظام ضربات القلب والسمية القلبية.
Introduction
خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى (hiPSC-CMs) هي المعيارالذهبي لعدد متزايد من المختبرات 1،2،3،4،5،6 ،7،8،9،10. ضرب الأجسام الجنينية11،12،13 وأحادية الطبقة3،7،10،11،12، 13،14،15،16،17 التمايز هي الطرق المفضلة لإنتاج خلايا القلب ومجموعة متعددة الأقطاب (الشرق الأوسط ورابطة الشرق الأوسط والأوسط) أصبحت طريقة مشتركة لمراقبة الديناميكا الكهربائية لهذه الشبكات18،19،20. في حين أن المعلمات التي يمكن استخراجها من الإمكانات الميدانية (FPs) مثل معدل الضرب، والسعة، والمدة وفترات RR هي استجابات كهرولوجية أساسية من الضرب تلقائيا أحادية الطبقات18،21، 22،23، وإمكانات العمل (AP) مكونات الكامنة وراء هذه الإشارات FP خارج الخلية من الصعب استقراء24. لدينا منشور حديث عن اكتشاف تطبيق الجوانب الالتجارية عبر علم الجوانب القصيرة المصدر لقياسات AP المتكررة المباشرة يوفر دليلا على منهجية للمقومات AP مثالية داخل الخلايا مع تحليل الموجي واسعة النطاق في مختلف مراحل إعادة الاستقطاب عبر متعددة دفعات من شبكات خلايا القلب المستمدة hiPSC3. في الدراسة أظهرنا أن تسليم النبضات الكهربائي إلى شبكات خلايا القلب المشتقة من hiPSC تمكن الوصول داخل الخلايا لتسجيلات AP. هذه التسجيلات AP عابرة تعتمد على التعافي المحتملةعبر الغشاء لوحظ من خلال موقع الإصابة 3،25،26. وأظهرت الأشكال الموجية المسجلة عن طريق الشرق الأوسط والإدارة والتصحيح المشبك في دراستنا مورفولوجياس AP مماثلة وبالتالي التحقق من موثوقية النهج3.
وقد ذكرت بعض المختبرات قياس APs من مختلف الخلايا الكهربائية باستخدام الجوانب المنخفضة الصنع حسب الطلب18،21،26،27،28،29، 30، ولكن لم يتم تقييم موثوقية استخدام الجوانب الجوانب الجوانب الحياتية المتعددة السنوات لقياسات AP متسقة ومتكررة. حاليا، ويقتصر الذهب القياسية التصحيح المشبكتقنية التسجيلات الطرفية 7،31 في حين أن، القياسات AP المستندة إلى الشرق الأوسط والشرق الأوسط وذلك العابرة، وبالتالي يمكن إجراؤها عدة مرات على نفس الخلية. كما نبين أنه يمكن للمرء أن يسجل بسهولة إشارات AP عالية الجودة في نطاق ميليفولت تتطلب الحد الأدنى من التصفية. ولذلك يمكن للباحثين أن يجروا دراسات لا حادة فحسب بل ومزمنة أيضا في المستحضرات نفسها باستخدام الجوانب البيئية المتعددة الجوانب. نظرا ً للتركيز المتزايد على التنبؤ باضطراب نظم القلب والسمية القلبية المرتبطة بالمخدرات24و32و33و34و35، دمج قياس AP وستعزز النُهُج تقييمات سلامة المخدرات وفعاليتها.
هنا، نقدم بروتوكولات ل1) ما قبل الطلاء من hiPSC-CMs حفظها بالتبريد للنضج، 2) فصل والطلاء من hiPSC-CMs على الاتفاقيات المتعددة الجوانب المنخفضة والمتوسطة، 3) تسجيل الملوثات التي يمكن ترتيبها ونقاط العمل من شبكات hiPSC-CM، 4) تجزئة واستخراج البيانات للتحليل، و 5) استعادة الصفائف لإعادة استخداممتعددة. وقد تم تحسين كل خطوة إلى أقصى حد مع التركيز على الخطوات الحاسمة حيثما كان ذلك مناسبا. تتم مناقشة متطلبات مرفق الخلية لضمان الضرب أحاديالطبقة المتزامنة وشرح إجراءات استعادة MEA متعددة الآبار للدراسات الكهرولوجية المتكررة. وأخيراً، يتم تقديم واجهة المستخدم الرسومية المخصصة التي تم تطويرها في المختبر لاستخراج إشارة AP، وضمان الجودة، وسير عمل التجزئة لتحديد وتحليل معلمات AP.
Protocol
Representative Results
Discussion
على مر السنين، تم تحديد تطبيق الجوانب الحياتية البحرية المحدودة على إجراء قياسات FP للخلايا المنفعلة لدراسة خصائصها الكهرولوجية36،37،38،39. وقد ذكرت مجموعات قليلة فقط آثار AP من الخلايا الكهربائية باستخدام التكنولوجيا المخصصة MEA القائم18،29،30. غير أن هذه النهج لم يتم التحقيق فيها فيما يُجرى تسجيلها المتكرر من نفس الأعمال التحضيرية. قمنا بتطوير منهجية مبتكرة ودقيقة لدراسة برامج العمل من نفس موقع الخليةعلى مدى أيام في شبكات hiPSC-CM متعددة في وقت واحد 3. في دراستنا المنشورة، تم استخدام منصة MEA متعددة الآبار الصغيرة من الذهب الصغير لتوليد مكتبات شكل موجي AP من دفعات متعددة من الثقافات hiPSC-CM بدقة عالية وبدقة زمنية تبلغ 1 μs. يشرح البروتوكول الموضح هنا البذر من hiPSC-CMs على مجموعة من أجل التطوير الفعال لشبكات CM المتزامنة لتسجيلات AP عالية الإنتاجية. العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي: 1) إنتاج دفعات متعددة عالية النقاء من أجهزة الصراف الآلي التي تسيطر عليها الجودة للخدمات المصرفية للحفظ بالتبريد، 2) أجهزة التخزين CMs ما بعد الذوبان قابلة للحياة للغاية لطلاء ما قبل والنضج، 3) علاج لوحة الشرق الأوسط والمياه متعددة الآبار لCM البذر، 4) التفكك الثقافي hiPSC-CM في 30 يوما بعد التمايز لطلاء الشرق الأوسط والإدارة، و 5) استعادة القطاعات البحرية المتعددة الأطراف لإعادة استخدام متعددة.
من المهم ملاحظة أن التباين من دفعة إلى دفعة في تمييز hiPSC قد يؤثر على النتائج التجريبية. تم تحسين طريقة أحادية الطبقة من التمايز في المنزل لإنتاج خلايا القلب عالية في المئة3،40. تحليل FACS من MLC2V وعلامات TNNT2 من ثقافاتنا تظهر ≥ 90٪ البطيني مثل النمط الظاهري3. يتم حفظ هذه الثقافات التي تسيطر عليها الجودة بالتبريد للدراسات التجريبية. نهج التمايز الحالي تسفر عن مزيج غير متجانس من الخلايا العقدية والأذينية والبطينية3و16و17و41. ولذلك، فإن الاستراتيجيات المستخدمة لإثراء السكان من النوع الفرعي CM يمكن أن تزيد من تحسين خصوصية الثقافات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام نُهج هندسة الأنسجة لتعزيز نضجها. ويمكن بسهولة تنفيذ الأساليب المقترحة هنا لمصادر CM الأخرى.
وكانت الموجات AP المسجلة باستخدام الشرق الأوسط والأوسط وذلك من خلال تسجيل من شبكات خلايا القلب عن طريق رسم الخرائط البصرية42،43، وأكسيد المعادن التكميلية المستندة إلى أشباه الموصلات MEA18،21، ومحاكاة AP باستخدام تسجيلات FP20. لمعالجة آلية قياسات AP عن طريق الشرق الأوسط والأوسط وذلك في جميع المجالات أظهرت أن واجهة الكهربائي الكهربائي تحاكي تقنية الأقطاب الدقيقة الزجاجية الحادة الراسخة. ومع ذلك، لا يمكن تحديد إمكانات غشاء يستريح وقيم السعة الحقيقية في دراستنا بالنظر إلى أن واجهة الكهربائي الكهربائي في أنظمة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط ومنطقة البحر تقنيه. نهجنا يشارك قيود مماثلة لرسم الخرائط البصرية عندما يتعلق الأمر سعة AP.
وقد فتحت التلاوة المتعددة الوسائط المتعددة القائمة على نظام الأغذية الأوسط ومنطقة الشرق الأوسط والأوسط للأدوية المفتوحة هنا إمكانيات جديدة لتقييم سلامة المخدرات. على الرغم من عفوية، هذه الطبقات الأحادية hiPSC-CM فاز بمعدلات ثابتة. تحليل معلمات APD عبر شبكات متعددة توفر نظرة ثاقبة على عدم التجانس الكهربائية (الشكل13). ومع ذلك، يجب أن تتضمن التحليلات الشاملة لرد الممتلكات APD الفترات الانبساطيالسابقة. وعلاوة على ذلك، فإن الطول الموجي عالي الجودة AP المسجل من نفس موقع الخلية أكثر من 96 ساعة (الشكل11B)هو أول تقرير لتتبع الديناميكا الكهربائية الغشاء مع مرور الوقت والتي ستكون ذات قيمة في التنمية وفي المرض.
ويمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لتحديد بارامترات AP كمياً لتوليد منحنيات الاستجابة للجرعة لاختبار المركبات. وكما ذكر مؤخراإدواردز وآخرون3، يتم رسم استجابة جرعة من إفراز، isoproterenol و E 4031 لAPD في مراحل إعادة الاستقطاب المختلفة. وأظهرت الدراسة المنشورة دقة وموثوقية النهج لتحديد التغيرات الدقيقة المعتمدة على الجرعة في أشكال الموجات AP في الوقت الحقيقي. ويمكن بسهولة توسيع هذه التقنية للمركبات الأخرى أو مكتبات الجزيئات الصغيرة لفهم مختلف الاستجابات الكهرولوجية.
النهج القائم على الشرق الأوسط وة الشرق الأوسط والأوسط لقياسات AP المعروضة في هذه الدراسة سيكون من مصلحة ليس فقط لعلماء الفيزيولوجيا الكهربائية ولكن أيضا لعلماء الأحياء الخلية والنماذج في سيليكو. وعلاوة على ذلك، فإن تسجيلات FP/AP من نفس موقع الخلية على hiPSC-CMs ستمكن الباحثين من إنشاء مكتبات بيانات كهربائية حيوية من مجموعة واسعة من الشبكات الخلوية المنفعلة في غضون فترة قصيرة من الزمن. وسيكون توافر هذه الموارد ذا قيمة بالنسبة لاكتشافات الأدوية ونمذجة الأمراض.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي
Materials
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
| Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
| Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
| D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
| Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
| Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
| Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
| Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
| 6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |
Referencias
- Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
- Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
- Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
- Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
- Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
- Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
- Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
- Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
- Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
- Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
- Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
- Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
- Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
- Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
- Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
- Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
- Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
- Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
- Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
- Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
