Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas
Summary
Dit protocol beschrijft een reproduceerbare methode voor isolatie van muizen rhabdomyosarcoom primaire cellen, tumorsphere vorming en behandeling, en transplantaat transplantatie vanaf tumorspheres culturen.
Abstract
Rhabdomyosarcoom (RMS) is het meest voorkomende wekedelensarcoom bij kinderen. Hoewel aanzienlijke inspanningen de identificatie van gemeenschappelijke mutaties in verband met RMS mogelijk hebben gemaakt en discriminatie van verschillende RMS-subtypen hebben toegestaan, bestaan er nog steeds grote uitdagingen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen om de prognose verder te verbeteren. Hoewel geïdentificeerd door de uitdrukking van myogenic markers, er is nog steeds belangrijke controverse over de vraag of RMS myogenic of niet-myogenic oorsprong heeft, als de cel van oorsprong nog steeds slecht wordt begrepen. In de huidige studie wordt een betrouwbare methode geboden voor de tumorsphere assay voor muis RMS. De assay is gebaseerd op functionele eigenschappen van tumorcellen en maakt het mogelijk de identificatie van zeldzame populaties in de tumor met tumorigene functies. Ook beschreven zijn procedures voor het testen van recombinante eiwitten, het integreren van transfectie protocollen met de tumorsphere Assay, en het evalueren van kandidaatgenen die betrokken zijn bij tumor ontwikkeling en groei. Verder beschreven is een procedure voor allotransplantaat transplantatie van tumorferen in ontvangende muizen te valideren tumorigene functie in vivo. Over het algemeen maakt de beschreven methode betrouwbare identificatie en het testen van zeldzame RMS tumorigene populaties die kunnen worden toegepast op de RMS die in verschillende contexten. Tot slot, het protocol kan worden gebruikt als een platform voor drug screening en toekomstige ontwikkeling van Therapeutics.
Introduction
Kanker is een heterogene ziekte; Bovendien kan hetzelfde type tumor verschillende genetische mutaties bij verschillende patiënten presenteren, en binnen een patiënt bestaat een tumor uit meerdere populaties cellen1. Heterogeniteit vormt een uitdaging bij de identificatie van cellen die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en propageren van kanker, maar hun karakterisering is essentieel voor de ontwikkeling van efficiënte behandelingen. De notie van tumor propageren cellen (TPC), een zeldzame populatie van cellen die bijdragen aan de ontwikkeling van de tumor, is eerder uitgebreid beoordeeld2. Ondanks het feit dat tpc’s zijn gekenmerkt in meerdere soorten kanker, de identificatie van markers voor hun betrouwbare isolatie blijft een uitdaging voor verschillende tumortypes3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. zo kan een methode die niet afhankelijk is van moleculaire markers, maar eerder van functionele eigenschappen van TPC (hoge zelf vernieuwing en de mogelijkheid om te groeien in omstandigheden met weinig gehechtheid), bekend als de tumorsphere Formation Assay, op grote schaal worden toegepast voor de identificatie van Tpc’s van de meeste tumoren. Belangrijk is dat deze test ook kan worden gebruikt voor de uitbreiding van tpc’s en dus rechtstreeks wordt toegepast op de screening van kankergeneesmiddelen en studies over kanker resistentie1,10.
Rhabdomyosarcoom (RMS) is een zeldzame vorm van wekedelensarcoom die het meest voorkomt bij jonge kinderen11. Althoug RMS kan histologisch worden geïdentificeerd door middel van de beoordeling van de expressie van myogene markers, de RMS-cel van oorsprong is niet eenzijdig gekarakteriseerd als gevolg van de meerdere tumor subtypen en een hoge heterogeniteit van de tumor-ontwikkelings stimuli. Inderdaad, recente studies hebben gegenereerd belangrijke wetenschappelijke discussie over de vraag of de RMS van myogene of niet-myogenic oorsprong is, wat suggereert dat RMS kan voortvloeien uit verschillende soorten cellen, afhankelijk van de context12,13, 14 , 15 , 16 , 17. talrijke studies over RMS-cellijnen zijn uitgevoerd met de tumorsphere Formation assay voor de identificatie van trajecten die betrokken zijn bij de ontwikkeling van tumoren en de karakterisering van markers in verband met zeer zelfvernieuwings populaties 18 , 19 , 20 , 21.
Ondanks de mogelijkheid van tumorsphere Formation om RMS-cellen van oorsprong te identificeren, is echter nog geen betrouwbare methode beschreven die kan worden toegepast op primaire RMS-cellen. In deze context heeft een recente studie van onze groep een geoptimaliseerde tumorsphere-formatie test gebruikt voor de identificatie van de RMS-cellen van oorsprong in een Duchenne-spierdystrofie (DMD) muismodel22. Meerdere pre-tumorigenic celtypen, geïsoleerd uit spierweefsels, worden getest op hun vermogen om te groeien in lage-gehechtheid voorwaarden, waardoor de identificatie van spier stamcellen als cellen van oorsprong voor RMS in dystrofische contexten. Hier beschreven is een reproduceerbaar en betrouwbaar protocol voor de tumorsphere Formation assay (Figuur 1), die met succes is gebruikt voor de identificatie van uiterst zeldzame celpopulaties die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van de muis RMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meerdere methoden zijn gebruikt voor isolatie en karakterisering van Tpc’s van tumor heterogene celpopulaties: tumor clonogenic assays, FACS isolatie, en tumorsphere Formation assay. De tumor clonogene test werd voor het eerst beschreven in 1971, gebruikt voor stamcel studies, en pas later toegepast op de Kankerbiologie29,30. Deze methode is gebaseerd op de tumor stamcellen intrinsieke eigenschap om uit te breiden zonder beperkingen in zachte gels culturen<sup cl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11, en de NIH pilot Grant binnen het NCI Cancer Center steun Grant P30CA030199 aan A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
Referencias
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Investigación sobre el cáncer. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Investigación sobre el cáncer. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
