Síntese de um padrão Deuterated para a quantificação de 2-Arachidonoylglycerol em elegans do Caenorhabditis
Summary
Este trabalho descreve um método robusto e direto para detectar e quantificar o endocanabinóide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) em C. elegans. Um padrão analítico deuterado nos preparou e utilizou para a quantificação de 2-AG por diluição isotópica e cromatografia líquida-eletroestimulação por espectrometria de massas tandem-electrospray (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Este trabalho apresenta um método para preparar um padrão analítico para analisar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) qualitativamente e quantitativamente pela espectrometria de massas de ionização em tandem (LC-ESI-MS/MS) de cromatografia líquida-electrospray. Os endocanabinoides são conservados mediadores lipídicos que regulam vários processos biológicos em uma variedade de organismos. Em C. elegans, 2-AG foi encontrado para possuir papéis diferentes, incluindo a modulação da formação do Dauer e do metabolismo do colesterol. Este relatório descreve um método para superar as dificuldades associadas com os custos e a estabilidade de padrões deuterado exigidos para a quantificação 2-AG. O procedimento para a síntese do padrão é simples e pode ser executado em todo o laboratório, sem a necessidade para a perícia orgânica da síntese ou o equipamento especial. Além disso, é descrita uma modificação do método de Folch para extrair o padrão deuterado da cultura C. elegans . Finalmente, um método quantitativo e analítico para detectar 2-AG usando o análogo isotopicamente etiquetado estável 1-AG-d5 é descrito, que fornece resultados de confiança em um funcionamento rápido-cromatográfico. O procedimento é útil para estudar as funções múltiplas de 2-AG em C. elegans ao igualmente ser aplicável a outros estudos dos metabolitos em organismos diferentes.
Introduction
Os endocanabinoides regulam processos biológicos múltiplos em uma variedade de organismos e são mediadores lipídicos conservados1. Os primeiros endocanabinoides descobertos e mais bem caracterizados são anandamida (arachidonoylethanolamide, AEA) e 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Endocannabinoids desempenham muitos papéis críticos, incluindo os envolvidos em sistemas de recompensa cerebral, bem como a toxicodependência, memória, humor e processos metabólicos2. AEA e 2-AG são sintetizados somente quando necessário e têm períodos de vida curtos, e são degradados com a recaptação e a hidrólise da proteína do transporte3.
O uso de modelos animais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) tornou-se importante para estudar a grande variedade de processos biológicos, incluindo apoptose, sinalização celular, ciclo celular, polaridade celular, regulação genética, metabolismo, envelhecimento, e determinação do sexo4,5. Adicionalmente, C. elegans é um excelente modelo para estudar os papéis fisiológicos de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs). A AEA foi identificada em C. elegans e é reduzida restrição dietética6. Esta deficiência estende a vida útil do nematoide através de um mecanismo de restrição dietética que pode ser suprimida pela suplementação com o endocanabinoide. Recentemente, descobriu-se que 2-AG e AEA desempenham papéis fundamentais na regulação do tráfico de colesterol em C. elegans7. Mais importante, determinou-se que a suplementação com 2-AG exógeno pode resgatar Dauer prisão, que é causada pelo tráfico de colesterol prejudicada em Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.
Para obter uma melhor compreensão da relação 2-AG com o tráfico de colesterol e outros processos biológicos no nematódeo (i.e., sinalização monoaminérgica, nocicepção e locomoção), é crucial estudar este metabolito endógeno e como é afetados determinadas condições ambientais e dietéticas8,9,10,11,12,13. Portanto, é imperativo projetar e otimizar um método para detectar e quantificar 2-AG endógena em C. elegans que é simples de usar para cientistas de diferentes campos, especialmente aqueles que estudam o comportamento do nematódeo em relação a este endocanabinóide.
Em 2008, Lethonen e colegas de trabalho conseguiram identificar 2-AG e AEA em C. elegans utilizando métodos analíticos LC-MS14. Em 2011, conseguiram ampliar essa técnica para outros endocanabinoides15. Trabalhos mais recentes mostraram outros métodos analíticos que têm sido bem-sucedidos na detecção e quantificação de endocanabinoides em C. elegans, incluindoespectrometria de massas e GC-MS16,17,18, etem também foi relatado que métodos analíticos semelhantes podem ser expandidos para outros modelos19.
Os métodos analíticos previamente relatados usados para quantificar 2-AG em amostras biológicas envolvem geralmente o uso de padrões deuterado que são adquiridos comercialmente e exigem a disponibilidade para a compra20,21. Muitos padrões analíticos para a quantificação de LC-MS/MS de endocanabinoides estão disponíveis comercialmente a partir de diferentes fornecedores. No entanto, eles são caros, são sensíveis, e se tornam oxidados ao longo do tempo, devido à presença de múltiplas ligações duplas. As versões mais comuns destas normas baseiam-se no ácido araquidônico Octa-deuterado e são adequadas para quantificação por diluição isotópica LC-MS/MS14,22. Além disso, a maioria destes padrões são substituídos na posição 2 do glicerol, tornando-os instáveis na maioria das condições, uma vez que são propensas à migração de acilo19,23.
Para superar as dificuldades associadas aos custos e à estabilidade desses padrões deuterados, um método conveniente e simples é apresentado para elaborar um padrão analítico baseado em glicerol-d5. A sequência para preparar o padrão penta-deuterated requer um procedimento de três etapas que resulte no padrão 1-AG-d5, que é estável e não sofre migração de acilo (a principal questão quando se pretende sintetizar 2-monoacilgliceróis).
O objetivo principal aqui é mostrar um método simples e reprodutível para estudar 2-AG em C. elegans, incluindo a síntese do padrão analítico deuterado, preparação e extração das amostras de nematódeos e análise por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimento sintético é realizável sem o conhecimento orgânico sofisticado da síntese ou o equipamento especial, fazendo o apropriado para cientistas dos campos diferentes que estão estudando o comportamento de C. elegans a influência do endocanabinóide. O método também é expansível para outros modelos de estudo, tornando-o útil para diferentes alvos. O padrão, preparado como relatado aqui, foi aplicado para desenvolver com sucesso um método cromatográfico rápido e de confiança que permita a deteção e a quantificação eficazes de 2 AG em uma maneira reprodutível.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os endocanabinoides são uma classe de lipídios que têm sido implicados na regulação da formação de Dauer em C. elegans7. Mais especificamente, a síntese de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) é importante para o tráfico de colesterol e o desenvolvimento reprodutivo de vermes. Revela-se aqui que 2-AG, um ácido araquidônico que contem o endocannabinoid, é responsável para restituir a larva do Dauer a seu ciclo normal nos sem-fins que prejudicaram o metabolismo do colesterol…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Agencia Nacional de Promoción científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., e B.H.C. são companheiros da CONICET. D.d.M. e G.R.L. são membros da carreira de pesquisa da CONICET. Estamos gratos a Gonzalo Lamberto (INMET) para a análise LC-MS/MS e discussão útil. A filmagem e edição de vídeo foi feita por Ramiro Ortega e María Soledad Casasola da Dirección de comunicación de la Ciencia, Facultad de ciencia política y relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario em Rosario, Argentina.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
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