Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.
Abstract
Le isole pancreatiche comprendono cellule endocrine con modelli distintivi di espressione ormonale. Le cellule endocrine mostrano differenze funzionali in risposta a condizioni normali e patologiche. L’obiettivo di questo protocollo è quello di generare dati transcriptome di alta qualità e su larga scala di ogni tipo di cellula endocrina con l’uso di una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle singola basata su goccia. Tali dati possono essere utilizzati per costruire il profilo di espressione genica di ogni tipo di cellula endocrina in condizioni normali o specifiche. Il processo richiede un’attenta maneggevolezza, una misurazione accurata e un rigoroso controllo di qualità. In questo protocollo vengono descritti i passaggi dettagliati per la dissociazione, il sequenziamento e l’analisi dei dati delle isole pancreatiche umane. I risultati rappresentativi di circa 20.000 cellule di isolotto umano dimostrano il successo dell’applicazione del protocollo.
Introduction
Le isole pancreatiche rilasciano ormoni endocrini per regolare i livelli di glucosio nel sangue. Cinque tipi di cellule endocrine, che differiscono dal punto di vista funzionale e morfologico, sono coinvolte in questo ruolo essenziale: le cellule z-cellule producono glucagone, insulina a cellule z, somatostatina -cellule del PP, polipeptide pancreatica delle cellule PP e ghrelina di cellule sè1. La profilazione dell’espressione genica è un approccio utile per caratterizzare le cellule endocrine in condizioni normali o specifiche. Storicamente, la profilazione dell’espressione genica dell’intero islet è stata generata utilizzando il sequenziamento dell’RNA di microarray e di nuova generazione2,3,4,5,6,7 , 8. Sebbene l’intero trascrittoma dell’isolotto sia informativo per identificare le trascrizioni specifiche dell’organo e i geni candidati alla malattia, non riesce a scoprire l’eterogeneità molecolare di ogni tipo di cellula issolata. La tecnica della microdissection laser di cattura (LCM) èstata applicata per ottenere direttamente tipi di cellule specifici dalle isole 9,10,11,12 ma non è al di sotto della purezza della cellula mirata popolazione. Per superare queste limitazioni, lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) è stato utilizzato per selezionare specifiche popolazioni di cellule endocrine, come le cellule di z e z13,14,15,16 , 17 mi lato , 18.Inoltre, Dorrell et al. ha utilizzato un approccio di selezione FACS basato su anticorpi per classificare le cellule z in quattro sottopopolazioni19. Le cellule di isolotto in ordine FACS possono anche essere placcate per il sequenziamento dell’RNA di singole cellule; tuttavia, i metodi a piastre devono affrontare sfide di scalabilità20,21,22.
Per generare dati trascrittoma di alta qualità e su larga scala di ogni tipo di cellula endocrina, abbiamo applicato la tecnologia microfluidica alle cellule delle istome umane. La piattaforma microfluidica genera dati trascrittomi da un gran numero di singole cellule in modo ad alta velocità effettiva, alta qualità e scalabile23,24,25,26,27. Oltre a rivelare le caratteristiche molecolari di un tipo di cellula catturate in una grande quantità, la piattaforma microfluidica altamente scalabile consente l’identificazione di tipi di cellule rare quando vengono fornite abbastanza cellule. Quindi, l’applicazione della piattaforma alle isole pancreatiche umane ha permesso la profilazione di cellule sseriforanti, un raro tipo di cellula endocrina con funzione poco conosciuta a causa della sua scarsità28. Negli ultimi anni, diversi studi sono stati pubblicati da noi e altri riportano dati trascrittomi su larga scala di isole umane utilizzando la tecnologia29,30,31,32, 33. I dati sono disponibili al pubblico e risorse utili per la comunità delle isolotto per studiare l’eterogeneità delle cellule endocrine e le sue implicazioni nelle malattie.
In questo caso, descriviamo un protocollo di sequenziamento dell’RNA microfluidico a celle microfluidico basato sulle goccioline, che è stato utilizzato per produrre dati trascrittomi di circa 20.000 cellule di isole umane, tra cui 32. Il flusso di lavoro inizia con isolotti umani isolati e illustra i passaggi di dissociazione delle isolotti, acquisizione di una singola cella e analisi dei dati. Il protocollo richiede l’uso di isolotti appena isolati e può essere applicato alle isole provenienti da esseri umani e altre specie, come i roditori. Utilizzando questo flusso di lavoro, è possibile costruire atlas imparziale e completo delle celle isolotto e completo in condizioni di base e altre condizioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecnologie a cella singola sviluppate negli ultimi anni forniscono una nuova piattaforma per caratterizzare i tipi di cellule e studiare l’eterogeneità molecolare nelle isole pancreatiche umane. Abbiamo adottato un protocollo di isolamento microfluidico a singola cellula basato sulle goccioline e analisi dei dati per studiare le isole umane. Il nostro protocollo ha prodotto con successo dati di sequenziamento dell’RNA da oltre 20.000 singole cellule di istolette umane con variazioni relativamente piccole nella qualit…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nessuno
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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