JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

يركز هذا البروتوكول على تحديد البروتينات التي تربط فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. ويستخدم الكروماتوغرافيا تقارب مع فوسفات الإينوزيتول biotinylated أو فوسفوينوسيتيدات التي يتم تعطيلها عن طريق streptavidin إلى أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم تحديد فوسفات الإينوزيتول أو البروتينات الملزمة phosphoinositide عن طريق النشاف الغربية أو قياس الطيف الكتلي.

Abstract

ينظم فوسفات الإينوزيتول وفوسفينيوسيتيدس العديد من العمليات الخلوية في eukaryotes، بما في ذلك التعبير الجيني، والاتجار بين الحويصلات، ونقل الإشارة، والتمثيل الغذائي، والتنمية. هذه الأيض أداء هذا النشاط التنظيمي عن طريق ربط للبروتينات، وبالتالي تغيير المطابقة البروتين، والنشاط الحفاز، و / أو التفاعلات. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم الكروماتوغرافيا تقارب إلى جانب قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربية لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. يتم تمييز فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات كيميائيا مع البيوتين، الذي يتم التقاطه بعد ذلك عن طريق streptavidin مترافقمع مع أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم عزل البروتينات من خلال تقاربها من ملزمة للالمستقلب، ثم تُقطَّع وتُحدَّد عن طريق قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربي. هذه الطريقة لديها سير عمل بسيط حساس، غير مشع، خاليمن الدهون، وقابل للتخصيص، ودعم تحليل تفاعل البروتين والمستقلب بدقة. ويمكن استخدام هذا النهج في أساليب قياس الطيف الكتلي الكمي التي تحمل علامة الأحماض الأمينية لتحديد تفاعلات البروتين المستقلب في العينات البيولوجية المعقدة أو باستخدام البروتينات النقية. تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل البروتينات من التريبانوسوما بروسي، ولكن يمكن تكييفه مع الطفيليات البروتوزوان ذات الصلة ، الخميرة أو خلايا الثدييات.

Introduction

الفوسفات الإينوزيتول (IPs) وفوسفوينوسيتيدات (PIs) تلعب دورا مركزيا في علم الأحياء eukaryote من خلال تنظيم العمليات الخلوية مثل السيطرة على التعبير الجيني1،2،3، الاتجار الحويصلة 4، إشارة transduction5،6، التمثيل الغذائي7،8،9، والتنمية8،10. الوظيفة التنظيمية لهذه الأيض ينتج عن قدرتها على التفاعل مع البروتينات وبالتالي تنظيم وظيفة البروتين. عند الربط بواسطة البروتينات، قد تغير التأثيرات الدولية وPIs مطابقة البروتين11، النشاط الحفاز12، أو التفاعلات13 وبالتالي تؤثر على وظيفة الخلوية. يتم توزيع الـ IPs وPIs في مقصوراتدون خلوية متعددة، مثل النواة 2،3،14،15،الشبكية الإندوبلازمية16،17، البلازما غشاء1 وسيتوسول18، إما المرتبطة البروتينات3،19 أو مع RNAs20.

يؤدي انشقاق PI المرتبط بالغشاء (4,5)P2 بواسطة phospholipase C إلى إطلاق Ins(1,4,5)P3، والتي يمكن أن تكون فوسفورية أو منزوعة الفوسفور بواسطة كيناز IP وفوسفاتاس، على التوالي. الـ IPs هي جزيئات قابلة للذوبان يمكن ربطها بالبروتينات وممارسة الوظائف التنظيمية. على سبيل المثال، Ins(1,4,5)P3 في ميتازوان يمكن أن تكون بمثابة رسول الثاني عن طريق ربط مستقبلات IP3، مما يحفز التغيرات المطابقة مستقبلات وبالتالي الإفراج عن Ca2+ من مخازن داخل الخلايا11. Ins(1,3,4,5)P4 يربط إلى مجمع deacetylase الهيستون وينظم تجميع البروتين معقدة والنشاط13. وتشمل الأمثلة الأخرى على الوظيفة التنظيمية IPs السيطرة على منظمة الكروماتين21،RNA النقل22،23،RNA التحرير24،والنسخ1،2،3 . وعلى النقيض من ذلك ، غالبا ما ترتبط مؤشرات ببس مع توظيف البروتينات إلى غشاء البلازما أو أغشية الجهازية25. ومع ذلك، فإن خاصية الناشئة من PIs هو القدرة علىربط مع البروتينات في بيئة غير membranous 3،15،19،26. هذا هو الحال بالنسبة للعامل الستيرويدوجينيك مستقبلات النووية، والتي يتم تنظيم وظيفة التحكم النسخي من قبل PI (3،4،5) P319، وبوليميراز بولي-A التي يتم تنظيم النشاط الأنزيمي من قبل PI النووية (4،5) P226. وقد تبين دور تنظيمي للإيبي وPIs في العديد من الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة22،27، خلايا الثدييات19،23، Drosophila10 والديدان28. من المهم دور هذه الأيض في التربانوسوم، التي تختلف في وقت مبكر من النسب eukaryotic. هذه الأيض تلعب دورا أساسيا في تريبانوسوما بروسي التحكم النسخي1,3, تطوير8, التكوين الحيوي العضوي وحركة البروتين29,30 , 31 , 32، وتشارك أيضا في السيطرة على التنمية والعدوى في مسببات الأمراض T. كروزي33،34،35،توكسوبلازما36 والبلازموديوم 5 , 37– ومن ثم، فإن فهم دور الملوثات العضوية المُسَوِّعين والـ “بي آي آي” في التربانوسوم قد يساعد على توضيح الوظيفة البيولوجية الجديدة لهذه الجزيئات وتحديد أهداف جديدة للمخدرات.

خصوصية البروتين والملكية الفكرية أو ربط PI يعتمد على مجالات تفاعل البروتين وحالة الفوسفور من الإينوزيتول13،38، على الرغم من أن التفاعلات مع الجزء الدهني من PIs يحدث أيضا19. توفر مجموعة متنوعة من الـ IPs وPIs وكيناز وتعديلها وفوسفاتاتآلية خلوية مرنة للتحكم في وظيفة البروتين التي تتأثر بتوافر المستقلب ووفرة، وحالة الفسفور من الإينوزيتول، والبروتين تقارب التفاعل1،3،13،38. على الرغم من أن بعض مجالات البروتين تتميز بشكل جيد39،40،41،على سبيل المثال، مجال الهومولوجيا pleckstrin42 وSPX (S YG1 / P ho81 /XPR1) مجالات43 ،44،45، بعض البروتينات تتفاعل مع IPs أو PIs بواسطة الآليات التي لا تزال غير معروفة. على سبيل المثال، البروتين المقمع المنشط 1 (RAP1) من T. بروسي يفتقر إلى المجالات الملزمة PI الكنسية ولكن يتفاعل مع PI (3,4,5)P3 والنسخ التحكم في الجينات المشاركة في الاختلاف المضادة للجينات3. الكروماتوغرافيا التقاربية وتحليل الطيف الكتلي للبروتينات المتفاعلة IP أو PI من الخلايا التربانوسومأو الخميرة أو الثدييات حددت العديد من البروتينات دون مجالات مُعرفة ببروتوكول IP أو PI8،46، 47. وتشير البيانات مجالات البروتين غير مميزة إضافية التي تربط هذه الأيض. وبالتالي، فإن تحديد البروتينات التي تتفاعل مع الملوثات العضوية المُسَوِّقة أو الـ “بي آي” قد يكشف عن آليات جديدة للتفاعل بين البروتين والمستقلب والوظائف التنظيمية الخلوية الجديدة لهذه الجزيئات الصغيرة.

تستخدم الطريقة الموضحة هنا الكروماتوغرافيا المتقاربة إلى جانب النشاف الغربي أو قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات التي ترتبط بـ IPs أو PIs. ويستخدم الإيماء في الكائنات الحية أو PIs التي هي إما مرتبطة عبر streptavidin مترافقة مع حبات أغاروز أو بدلا من ذلك، التي تم التقاطها عن طريق الخرز المغناطيسي streptavidin المترافقة (الشكل1). توفر هذه الطريقة سير عمل بسيط حساس وغير مشع وخال ٍ من الدهون ومناسب للكشف عن ربط البروتينات من الليسات الخلوية أو البروتينات النقية3 (الشكل2). ويمكن استخدام هذه الطريقةفي 8أو46 أو إلى جانب قياس الطيف الكتلي الكمي المسمى بالأحماض الأمينية47 لتحديد البروتينات الملزمة للملكية الفكرية أو PI من العينات البيولوجية المعقدة. وبالتالي، فإن هذه الطريقة هي بديل للأساليب القليلة المتاحة لدراسة تفاعل النقاط التنفيذية أو مؤشرات ويب مع البروتينات الخلوية، وسوف تساعد في فهم الوظيفة التنظيمية لهذه الأيض في التربانوسوم وربما eukaryotes أخرى.

Protocol

1. تحليل البروتينات IP- أو PI ملزمة عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب والنشاف الغربية نمو الخلايا والخلايا والكروماتوغرافيا المتقاربة تنمو خلايا T. بروسي إلى مرحلة منتصف السجل ورصد صلاحية الخلية وكثافتها. يكفي ما مجموعه 5.0 × 107 خلايا لفاكس واحد ملزم. لأشكال مجرى…

Representative Results

تحليل RAP1 و PI(3,4,5)P3 التفاعل بواسطة الكروماتوغرافيا التقارب ية والنشاف الغربييوضح هذا المثال تطبيق هذا الأسلوب لتحليل ربط PIs بواسطة RAP1 من T. بروسي lysate أو عن طريق البروتين T. brucei RAP1 المؤتلف T. brucei. Lysates من T. بروسي أشكال مجرى الدم التي تعبر عن الهيماغلوتينين (HA) الموسومة RAP1…

Discussion

تحديد البروتينات التي تربط إلى IPs أو PIs أمر بالغ الأهمية لفهم الوظيفة الخلوية من هذه الأيض. يوفر التصوير اللوني المتقارب المقترن باللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي فرصة لتحديد البروتينات المتفاعلة بين بروتوكول الإنترنت وPI وبالتالي اكتساب رؤى حول وظيفتها التنظيمية. IPs أو PIs الموسومة كيمي…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل مجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC, RGPIN-2019-04658)؛ NSERC اكتشاف إطلاق الملحق للباحثين الوظيفي المبكر (DGECR-2019-00081) وجامعة ماكغيل.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O’Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O’Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains–their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton’s tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image