JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

Гемогенная дифференциация эндотелия от стволовых клеток человека в Feeder- и Ксено-свободноопределенное состояние

Published: June 16, 2019
doi:
10.3791/59823
, , ,
1Center for iPS cell research and application (CiRA)

Summary

Здесь мы представляем протокол, чтобы точно сформировать гемогенный эндотелий из человеческих плюрипотентных стволовых клеток в кормушки и ксено-свободного состояния. Этот метод будет иметь широкое применение в моделировании заболеваний и скрининге терапевтических соединений.

Abstract

Получение функциональных гематопоитических стволовых клеток и клеток-прародителей (HSPCs) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) было неуловимой целью для аутологичных трансплантаций для лечения гематологических и злокачественных расстройств. Гемогенный эндотелий (HE) является поддающейся платформе для производства функциональных HSPCs по транскрипции факторов или индуцировать лимфоциты в надежной манере. Тем не менее, текущие методы получения HE являются дорогостоящими или переменной в выходе. В этом протоколе мы разработали экономичный и точный метод получения HE в течение 4 дней в фидер- и ксено-свободноопределенном состоянии. В результате он прошел эндотелиальный к гематопоическому переходу и произвел CD34иCD45– клоногенные гематопоиетические прародители. Потенциальная способность нашей платформы для генерации функциональных HSPCs будет иметь широкое применение в моделировании заболеваний и скрининге терапевтических соединений.

Introduction

Разработка новых терапевтических средств для лечения гематологических и иммунологических расстройств затруднена отсутствием надежных платформ для моделирования заболеваний и высокой пропускной проликворемой скрининга лекарственных средств с аутологичными гематопоитическими стволовыми клетками (ГСК), полученными от пациента плюрипотентных стволовых клеток (ПСЦ). Прорыв индуцированной (i)PSC технологии обещает моделировать болезни из клеток пациентов, но создание функциональных HSCs от пациента iPSCs было неуловимым. Для того, чтобы получить HSCs из человека PSCs, надлежащей индукцииэмбриональных моделей и транскрипционных программ является ключевым 1,2,3,4,5,6, 7,8. Недавний прогресс в гематопоическом развитии продемонстрировал роль гемогенного эндотелия (HE) в развитии HSC9. Он может быть индуцирован из PSCs и поддается вниз по течению вмешательства, такие как передача генов10,11,12,13. Используя HE в качестве платформы, сочетание 5 транскрипционных факторов(ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) успешно индуцированных функциональных HSCs, которые прививают долгосрочные и дифференцировать в несколько линий14. Однако переменная и неэффективная генерация ЛГ из ЧоС препятствует систематическому манипуляции и анализу клеток наряду с готовым производством и крупномасштабной индукцией гематопогетических клеток для клинического использования.

Здесь мы описываем экономически эффективный и точный метод получения he в течение 4 дней с фидером- и ксено-свободного определенного состояния. В этом методе, сфероид образования и спонтанного повторного уплощения на iMarix-511 обеспечивает последовательную плотность psC колоний, что имеет решающее значение для эффективной индукции клеток ЕГ.

Protocol

1. Реагенты Клеточные линии (человеческие ПСК): получают либо эмбриональные стволовые клетки (ESC) или линии iPSC 409B2 и 201B7 (317-9)) и CBA11. Подготовка реагента PSC покрытие среды: смешать PSC техническое обслуживание среды с 10 ММ Y-27632 и хранить при 4 c. PSC SpC Spheroid плитка среды: смешать PSC техническое обслуживание среды с 625-1,250 нг/мл человека рекомбинантНый Laminin-511 E8 фрагмент (LM511-E8) (в зависимости от клеточной линии) непосредственно перед использованием.ПРИМЕЧАНИЕ: LM511-E8 можно смешивать в сми15. Другие матрицы, такие как полнометражный ламинин-511, должны быть предварительно покрыты, и даже сделали это, они не поддерживают мезодермальные органоиды, применяемые в процессе дифференциации. Среда дифференциации дня 0: смесь мезодермальной базальной среды с 2 мкм CHIR99021, 80 нг/мл морфогенетического белка кости 4 (BMP4) и 80 нг/мЛ Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Среда дифференциации дня 2: смешайте гемогечную базальную среду с 1 qM SB431542, 80 нг/мл VEGF и 100 нг/мл фактор стволовых клеток (SCF). Подготовка фосфатного буфера сольников (PBS) без кальция или магния (см. Таблицаматериалов). 1 мМ этиленедиаминетететацетокислота (ЭДТА) буфер: добавить 1 мл 0,5 М EDTA до 500 мл PBS. EHT средний: смесь гематопоиетическая базальная среда с 50 нг/мЛ SCF, 20 нг/мЛ тромбопоэтина (TPO), 50 нг/мЛ FMs связанных тирозина киназы 3 лиганд (Flt-3L), 20 нг/мЛ Интерлейкин-6/Интерлейкин-6-рецептор (IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL- инсулин-трансферрин-селениум-этаноламин, L-глутамин и пенициллин/стрептомицин/Амфотерицин В. FACS буфер: смесь PBS с 2% сыворотки плода теленка и 1 мМ EDTA. Подготовка магнитного буфера разделения (см. Таблица материалов). Подготовка метилцеллюлозы на основе средств массовой информации (см. Таблица материалов). 2. Формирование колонии PSC Выращивайте hPSCs до 70 – 80% вытежки на 0,5 мкг см-2 LM511-E8-покрытие 6-колодная пластина в mTeSR1 в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2. PSC диссоциации (День -4) Аспирируй среду и мыть клетки с PBS в два раза. Промыть клетки диссоциационным раствором. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин (клетки не будут осевкить в это время). Приостановить клетки в среде обслуживания PSC, передать подвеску в соответствующий размер трубки и центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспирировать супернатант и приостановить клетки в PSC покрытие среды. Плита PSC подвески при плотности 48000 – 70000 клеток см-2 (в зависимости от клеточной линии) на микро-изготовлены пластиковый сосуд и инкубировать на ночь в 37 C инкубатор с 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем 100 л хорошо-1 клеточной подвески в 96-хорошо микро-изготовленного пластикового сосуда. Вы, как правило, семена 20000 клеток хорошо-1 в 96-хорошо пластины, чтобы дать около 100 сфероидов. Плитка PSC сфероидов на LM511-E8 (День -3) Соберите PSC сфероидов в 15 мл конической трубки, мягко pipetting с помощью микропипеттера P1000 и оставить сфероидов стоять при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы осадок под действием силы тяжести. Аспирируй супернатанта. Приостановить в сфероидных покрытий среды, обойтись подвески в непокрытие 6-хорошо культуры пластины при плотности 4-сфероидов см-2 и культуры в 37 КК инкубатор с 5% CO2 в течение трех дней. 3. Гемогенная индукция (День 0) Прибавьте среду, добавьте среду дифференциации Day0 и культуру в инкубатор 37 градусов с 5% O2 и 5% CO2 (гипоксический инкубатор). После двух дней культуры в Day0 дифференциации среды, аспирировать среды, а затем добавить Day2 дифференциации среды и культуры в гипоксическом инкубаторе. 4. Изоляция гемогенного эндотелия (День 4) Два дня спустя, аспирируя среды и мыть клетки с PBS в два раза. Промыть клетки диссоциационным раствором. Инкубировать в инкубаторе 37 градусов с 5% CO2 в течение 30 мин. Аккуратно приостановить клетки в 1 мМ EDTA, чтобы отделиться от одноклеточного уровня, передать подвеску в 50 мл конической трубки и центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспир супернатант и приостановить клеточной гранулы с 300 л магнитного разделения Буфера. Добавьте 100 кл. микрошариков CD34и аккуратно пипетку. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Можно использовать до 20 миллионов ячеек на 100 л CD34и бусы. Фильтр подвески через 40 мкм ячейки ситечко. Отделите клетки CD34с помощью магнитного сепаратора. 5. Индукция эндотелиального к гематопогетному переходу (EHT) Фибронектин покрытие Подготовьте необходимый объем 5 мкг/мл фибронектина-покрытия раствора путем разбавления 1 мг/мл фибронектина в PBS. Распределите 0,5 мл покрытия раствора в каждой скважине из 24-хорошо культуры пластины. Инкубировать тарелку при комнатной температуре 30 мин. Centrifuge отсортированных клеток CD34на 200 х г в течение 3 мин. Отрежируйте клеточные гранулы в 1 мл среды EHT. Определите жизнеспособную плотность клеток с помощью клеточного счетчика. Отрегулируйте плотность клеток до 200 000 мл мл-1, добавив среду EHT. Аспирировать и отбрасывать покрытие раствор из фибронектина покрытием хорошо. Распределить 0,5 мл CD34и клеточной подвески в каждом фибронектин покрытием хорошо. Инкубировать в гипоксическом инкубаторе в течение одной недели. 6. Анализ цитометрии потока гематопоатических клеток Плавающая коллекция ячеек: Перенесите среду культуры в коническую трубку 15 мл. Центрифуги среды на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант. Коллекция клеток адепта Вымойте клетки с 0,5 мл PBS в два раза. Промыть клетки разъединяющим раствором и аспирировать излишки жидкости. Инкубировать тарелку в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Приостанавливай те ячейки в 1 мл буфера FACS. Смешайте плавающие клетки и клетки адептов. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант. Повторное действие в 50 зл буфера FACS. Инкубировать клетки анти-CD34 и анти-CD45 антителами на 1 ч при комнатной температуре в темноте. Вымойте клетки с PBS дважды и центрифуги на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант и повторно в 0,5 мл буфера FACS с 0,5 мкг /мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол. Измерьте экспрессию CD34 и CD45 по цитометропотокам потока. 7. Колония Формирование единицы (CFU) Асса гематопоитических клеток Коллекция гематопоитических клеток: Перенос среды из культуры в коническую трубку 15 мл. Аккуратно промыть колодец дважды с ПОМОЩЬю PBS. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант. Повторно ездовка в 1 мл среды EHT. Определите номер ячейки с помощью клеточного счетчика. Добавьте объем подвески, эквивалентный 10 000 клеток, до 3 мл средств массовой информации на основе метилцеллюлозы, дополненных антибиотиками, и хорошо перемешайте 5 раз со шприцем 16 G или 18 G. Распределите всю метилцеллюлозу основе медиа подвески в каждой скважине из 6-колодец пластины. Инкубировать в инкубаторе 37 градусов с 5% CO2 в течение двух недель, сохраняя при этом влажный. Не мешайте блюду. Колонии чувствительны к движению. Через две недели посчитайте колонии под микроскопом.

Representative Results

Схема формирования колоний ПСК изображена на рисунке 1A. PSC сфероиды образуются на микро-изготовлены пластиковые сосуды в течение одного дня. В результате 20 000 409B2 клеток могут быть обработаны на 96-ну хорошо микро-изготовленного пластикового сосуда, хотя другие клеточные линии могут потребовать более высокой плотности (30 000-40 000 клеток на 96-ну микро-изготовленного пластикового сосуда). Эти сферы спонтанно сплющены к почти двумерной культуре, когда покрываются на блюдо культуры в присутствии LM511-E8. Схема гемогенной индукции иллюстрируется на рисунке 1B. Когда колонии PSC растут до диаметра 750 мкм, среда последовательно изменяется, чтобы вызвать мезодермальные органоиды. Колонии PSC постепенно станут солнечной стороной вверх структура во время дифференциации к mesodermal органоидам последовательным средним изменением до дня 4. На 4-й день гемогеновые эндотелии определяются из мезодермальных органоидов магнитной сортировкой и затем покрываются фибронектином в среде EHT. 5-10 миллионов CD34иCD45- клетки, как ожидается, от сфероидов, содержащих 1 миллион PSCs (рисунок1C). Отмечается, что клетки морфологически меняются от эндотелиальных к гематопогетическим клеткам(Дополнительное видео 1). Репрезентативное фазово-контрастное изображение клеток гематопоиетического прародителя при стимуляции гематопоиетическим коктейлем на 7-й день показано на рисунке 2A. В культуре появились колонии гематопоитических клеток. Представительный участок цитометрии потока показан на рисунке 2B. Вся культура стимулируется гематопоитическим коктейлем и на 7-й день анализируется на выражение CD34 и CD45 цитометрией потока. Клетки гематопоиетического прародителя выражают CD34 и CD45. Анализ CFU показал, что поколение гранулоцитов/макрофагов колоний из CD34и CD45- гематопоиетических клеток-прародителей (рисунок2C). Расчетное число колоний составляет 38 CFU-G/M на 10 000 клеток(рисунок 2D) Рисунок 1: Схема черепичных колоний ПСК и последующая гематопоитическая дифференциация через гемогеновые эндотелии. (A) Схематический процесс формирования колоний PSC. PSC поддерживаются на LM511-E8 покрытием 6-колодец пластины в PSC техническое обслуживание среды. На день -4, клетки отделены и отделены к одноклеточному уровню используя dissociating разрешение, затем покрывающ на микро-изготовленном пластичном сосуде в средстве обслуживания PSC с Y-27632 и культивированы всю ночь для того чтобы сформировать spheroids. На день -3, сфероиды покрываются в PSC обслуживания среды с LM511-E8 и культивируется в течение трех дней. К 0-му дню сфероиды спонтанно сплющиваются к почти двумерной культуре. Шкала баров 200 мкм. (B) На день 0, среда заменяется Day0 дифференциации среды и культивируется в гипоксическом инкубаторе. На второй день дифференциации, среда заменяется Day2 дифференциации среды. На 4-й день обогащения гемогенного эндотелия, клетки CD34и магнитно отсортированы и культивируются на фибронектин-покрытие 12-колодцов пластины в среде EHT в течение 6 дней. (C) Представитель flowcytometry сюжет CD45 и CD34 выражение дня 4 клетки отсортированы по CD34. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Анализ гематопоитического свойства. (A) Представитель фазово-контрастное изображение клеток гематопоиетического прародителя после стимуляции гематопойетическим коктейлем на 7-й день. Шкала бар 200 мкм. (B) Представитель потока цитометрии сюжет CD45 и CD34 выражение всей культуры при стимуляции с гематопогетическим коктейлем на 7-й день. (C) Представитель фазового контрастного изображения гранулоцитов / макрофаг колонии порожденных из 11 гематопоиетических клеток-прародителей. Шкала бар 500 мкм. (D) Количество CFUs на 10000 клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительное видео 1: Видео EHT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Наш метод индукции без фидера и ксено предлагает точную и экономичную платформу для вывоза клеток HE масштабируемым образом. Точное образование гемогенного эндотелия в обычных протоколах10,11,12,13,14 было затруднено из-за отсутствия точного контроля плотности и размера колонии ПСК, которая влияет на эффективность дифференциации направленной на основе морфогена/цитокинов. Мы испытали несоответствие индукции гемогенного эндотелия в каждой независимой партии от обычных протоколов. Новый протокол позволяет жестко регулировать плотность и размер колонии PSC, таким образом, преодолевает несоответствие индукции гемогенного эндотелия.

Мы использовали униформу формирования сфероидов, а затем передал фидер- и ксено-свободного определенного состояния, чтобы сформировать его в общей сложности 4 дней. Мы подтвердили, используя три независимые клеточные линии, что сфероид образования обеспечивает последовательное образование клеток He. В результате 409B2 клеточные линии дали 12,7%-23,6% эффективности клеток CD34 на основе трех независимых экспериментов. Критическим фактором для плитки PSC сфероидов является LM511-E8. Мы не рекомендуем заменять это с другими матрицами, такими как Matrigel или полнометражные продукты ламинина в нашем опыте. Мы испытали, что мезодермальные органоиды были легко отделены от Matrigel и потеряны в процессе дифференциации. И ни matrigel, ни полнометражный ламинин не закрепляют клетки без предварительного покрытия.

Потенциальное ограничение этого протокола заключается в том, что мы зависим от среды обслуживания PSC для поддержания PSCs. Мы протестировали другие носители, такие как StemFit, но мы скомпрометировали гемогенную индукцию. Предположительно клетки были устойчивы к выходу из плюрипотентного состояния в нашем коротком времени (4 дня) индукционного протокола. Если один поддерживает PSCs в других средствах массовой информации, мы рекомендуем адаптировать клетки в среде обслуживания PSC и провести несколько проходов до дифференциации. Эта платформа позволит систематические манипуляции и анализа клеток, а также готовые производства и крупномасштабной индукции гематопоэтиных клеток для потенциального клинического использования. Долгосрочной целью этой системы является моделирование заболеваний иммунодефицита в гуманизированных моделях мышей для исследования ответственных клеточных и молекулярных механизмов и проведения скринингов лекарственных средств.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Алине Ли и Сейко Бенно за техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить г-жу Харуми Ватанабэ за оказание административной помощи и д-ра Питера Карагианниса за редактирование документа. Эта работа была поддержана основным Центром исследований ячеек IPS Исследовательского центра сети по реализации регенеративной медицины от Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED) «M.K.S.», Программы исследований неразрешимых болезней Используя. Специфические для болезней клетки iPS AMED (17935423) «M.K.S.» и Программа Центра инноваций Японского научно-технического агентства (JST) «R.O. и M.K.S.».

Materials

0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575 0.5M EDTA
40 μm cell strainer Corning 352340 40μM cell strainer
6 well plate Corning 353046 6 well plate
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-112 Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B
anti-CD34 antibody Beckman Coulter A07776 anti-CD34 antibody
anti-CD45 antibody Biolegend 304012 anti-CD45 antibody
BMP4 R&D Systems 314-BP-010 BMP4
CD34 microbeads Miltenyi 130-046-703 CD34 microbeads
CHIR99021 Wako 038-23101 CHIR99021
Essential 6 Thermo Fisher Scientific A15165-01 Hemogenic basal medium
Essential 8 Thermo Fisher Scientific A15169-01 Mesodermal basal medium
Ezsphere SP Microplate 96well AGC 4860-900SP micro-fabricated plastic vessel 
FCS Biosera FB-1365/500 FCS
Fibronectin Millipore FC010-100MG Fibronectin
Flt-3L R&D Systems 308-FK-005 Flt-3L
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine
IL-6/IL-6Rα R&D Systems 8954-SR IL-6/IL-6Rα
iMatrix-511 Matrixome 892 001 LM511-E8
ITS-X Thermo Fisher Scientific 51500-056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine
MACS buffer Miltenyi 130-091-221 magnetic separation buffer
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched STEMCELL TECHNOLOGIES 04435 Methylcellulose-based media
mTeSR1 STEMCELL TECHNOLOGIES 85850 PSC maintenance medium
PBS nacalai tesque 14249-24 PBS
SB431542 Wako 031-24291 SB431542
SCF R&D Systems 255-SC-010 SCF
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium Sigma Aldrich S0192-500ML Hematopoietic basal medium
TPO R&D Systems 288-TPN TPO
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12604-021 dissociation solution
VEGF R&D Systems 293-VE-010 VEGF
Y-27632 Wako 253-00513 Y-27632
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  2. Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
  3. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  4. Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
  5. Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
  6. Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
  7. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  8. Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don’t forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
  9. Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
  10. Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261 (2011).
  11. Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
  12. Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
  13. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
  14. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  15. Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165 (2017).

Tags

Hemogenic EndotheliumPluripotent Stem CellsFeeder-freeXeno-freeBlood CellsHematologyImmunologyGenetic InterventionGene EditingLM511-E8PSC ColoniesDissociation BufferDifferentiationHypoxiaCulture Conditions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition. J. Vis. Exp. (148), e59823, doi:10.3791/59823 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image