Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

1. Reagenti Linee cellulari (PSC umane): ottenere cellule staminali embrionali (ESC) o linee iPSC 409B2 e 201B7(317-9)) e CBA11. Preparazione del reagente Mezzo di placcatura PSC: mescolare il supporto di manutenzione PSC con 10 SM Y-27632 e conservare a 4 gradi centigradi. PsC Spheroid appunta media: mescolare il mezzo di manutenzione PSC con 625–1,250 ng/mL ricombinante umano Laminin-511 E8 frammento (LM511-E8) (a seconda della linea cellulare) poco prima dell’uso. NOT:</ LM511-E8 può essere miscelato in supporti15. Un’altra matrice, come la laminina-511 a lunghezza intera, deve essere prerivestita, e anche lo ha fatto, non sostengono gli organorizzati mesodermici adered adered durante il processo di differenziazione. Giorno 0 differenziazione media: mescolare il mezzo basale mesodermico con 2 unità DiM, 80 ng/mL proteina morfogenetica dell’osso 4 (BMP4) e 80 ng/mL Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Mezzo di differenziazione del secondo giorno: mescolare il mezzo basale emogenico con 1 SB431542, 80 ng/mL VEGF e 100 ng/mL Fattore di cellule staminali (SCF). Preparare il buffer di fosfato (PBS) senza calcio o magnesio (vedere Tabella dei materiali). Buffer di acido etilenediaminea-tracetaceto (EDTA): aggiungere 1 mL di 0,5 M EDTA a 500 mL di PBS. EHT medio: mescolare mezzo basale ematopoietico con 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL Fms-correlate tirosine chinaase 3 ligando (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/Interleukin-6 recettore alfa (IL-6/IL-6R), insulino-trasferino-selenio-etanolamina, L-glutamina e Penicillina/Streptomycin/Amphotericin B. Buffer FACS: mescolare PBS con 2% siero di vitello fetale e 1 mM EDTA. Preparare il buffer diseparazione magnetica (vedere Tabella dei materiali ). Preparare i supporti basati sulla metilcellulosa (vedere Tabella dei materiali). 2. Formazione colonia PSC Coltivare hPSCs fino a 70 – 80% di confluenza su una piastra 6-po rivestita di 4 LM511-E8 rivestita in mTeSR1 in un’incubatrice 37 C con 5% di CO2. Dissociazione PSC (Giorno -4) Aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS due volte. Sciacquare le cellule con soluzione di dissociazione. Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min (le cellule non si scistreranno in questo momento). Sospendere le cellule nel mezzo di manutenzione PSC, trasferire la sospensione in un tubo di dimensioni adeguate e centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirate il supernatante e sospendere le cellule in PSC plating medium. Piastra recellina della sospensione PSC ad una densità di 48.000 – 70.000 cellulecm -2 (a seconda della linea cellulare) su un recipiente di plastica microfabbricato e incubare durante la notte nell’incubatrice di 37 gradi centigradi con 5% di CO2. NOT:</ Si consiglia un pozzo di 100 -1 di sospensione cellulare in un recipiente di plastica microfabbricato da 96 pozze. In genere si seminano 20.000 cellule ben-1 in una piastra di 96 pozzetti per produrre circa 100 sferoidi. Appuntando sferoidi PSC su LM511-E8 (Giorno -3) Raccogliere gli sferoidi PSC in un tubo conico da 15 mL pipettando delicatamente con micropipetter P1000 e lasciare che gli sferoidi si fermino a temperatura ambiente per 2 min per precipitare per gravità. Aspirare il super-attuoso. Sospendere nel mezzo di placcatura sferoide, erogare la sospensione in una piastra di coltura a 6 pozze non rivestita ad una densità di 4-spheroids cm-2 e coltura nell’incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per tre giorni. 3. Induzione emogenica (giorno 0) Aspirare il mezzo, aggiungere il mezzo di differenziazione Day0 e la coltura nell’incubatore di 37 gradi centigradi con il 5% O2 e 5% di CO2 (incubatore ipossico). Dopo due giorni di cultura nel mezzo di differenziazione Day0, aspirare il mezzo, quindi aggiungere Day2 differenziazione medio e cultura nell’incubatrice ipossica. 4. Isolamento dell’endotelio emogenico (giorno 4) Due giorni dopo, aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS due volte. Sciacquare le cellule con soluzione di dissociazione. Incubare nell’incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 30 min. Sospendere delicatamente le cellule in 1 mM EDTA per dissociare al livello a cella singola, trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 mL e centrificare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirare il supernatante e sospendere il pellet cellulare con 300 buffer m inv. Aggiungete 100 l di CD34e fate pipistrare delicatamente. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. È possibile utilizzare fino a 20 milioni di celle per CD34 da 100 . Filtrare la sospensione attraverso un colino cellulare da 40 m. Separare il CD34- celle utilizzando un separatore magnetico. 5. Induzione della transizione endoteliale-ematopoietica (EHT) Rivestimento di fibronectina Preparare il volume richiesto di 5 mafibrosi di 5 g/mL con la diluizione di 1 fibronectin a mg/mL in PBS. Distribuisci 0,5 mL della soluzione di rivestimento in ogni pozzo di una piastra di coltura di 24 pozze. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 min. Centrifugare il CD34 ordinato- cellule a 200 x g per 3 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo EHT. Determinare la densità delle cellule vitali con il contatore cellulare. Regolare la densità della cella a 200.000 celle mL-1 aggiungendo il supporto EHT. Aspirare e scartare la soluzione di rivestimento dal pozzo rivestito di fibronectina. Distribuisci 0,5 mL di CD34- sospensione cellulare in ogni pozzo rivestito di fibronectina. Incubare nell’incubatrice ipossica per una settimana. 6. Analisi della citometria di flusso delle cellule ematopoietiche Raccolta di celle mobili: Trasferire il mezzo di coltura in un tubo conico da 15 mL. Centrifugare il mezzo a 200 x g per 3 min. Aspirate il supernatante. Raccolta di cellule aderenti Lavare le cellule con 0,5 mL di PBS due volte. Sciacquare le cellule con soluzione dissociante e aspirare il liquido in eccesso. Incubare la piastra nell’incubatrice da 37 gradi centigradi per 5 min. Risospendere le celle in 1 mL di buffer FACS. Mescolare le cellule galleggianti e le cellule aderenti. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirate il super-natante. Risospendere in 50 : L di buffer FACS. Incubare le cellule con anticorpi anti-CD34 e anti-CD45 per 1 h a temperatura ambiente al buio. Lavare le cellule con PBS due volte e centrifugare a 200 x g per 3 min. Aspirare il supernatante e respendere in 0,5 mL di tampone FACS con 0,5 g / mL 4′,6-diamidino-2-fenilondole. Misurare l’espressione CD34 e CD45 per citometro di flusso. 7. Unità di formazione colonia (CFU) Saggio di cellule ematopoietiche Raccolta di cellule ematopoietiche: Trasferire il mezzo dalla coltura a un tubo conico da 15 mL. Sciacquare delicatamente il pozzo due volte con PBS. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min. Aspirate il super-natante. Risospendere in 1 mL di mezzo EHT. Determinare il numero di cella con il contatore di celle. Aggiungere un volume di sospensione equivalente a 10.000 cellule a 3 mL di media a base di metilcellulosa integrati con antibiotici e mescolare bene 5 volte con una siringa da 16 G o 18 G. Distribuisci l’intera sospensione multimediale a base di metilcellulosa in ogni pozzo di una piastra di 6 pozze. Incubare nell’incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per due settimane mantenendosi umido. Non disturbare il piatto. Le colonie sono sensibili al movimento. Dopo due settimane, contare le colonie al microscopio.