تصوير إنتاج غاما للإنترفيرون في الموقع في طحال الفأر بعد عدوى الليستيريا أحادية الخلايا
Summary
هنا، نقوم بوصف طريقة تصوير بؤرية بسيطة لتصور التوطين في الموقع للخلايا التي تفرز غاما الإنترفيرون السيتوكين في الأعضاء اللمفاوية الثانوية المورين. يمكن توسيع هذا البروتوكول لتصور السيتوكينات الأخرى في الأنسجة المتنوعة.
Abstract
السيتوكينات هي بروتينات صغيرة تفرزها الخلايا، وتوسط الاتصالات الخلية الخلية التي هي حاسمة للاستجابات المناعية الفعالة. إحدى خصائص السيتوكينات هي الجنبية، كما أنها تنتج من قبل ويمكن أن تؤثر على العديد من أنواع الخلايا. على هذا النحو، من المهم أن نفهم ليس فقط الخلايا التي تنتج السيتوكينات، ولكن أيضا في البيئة التي يفعلون ذلك، من أجل تحديد علاجات أكثر تحديدا. هنا، ونحن نصف طريقة لتصور إنتاج السيتوكين في الموقع بعد العدوى البكتيرية. تعتمد هذه التقنية على تصوير الخلايا المنتجة للسيتوكين في بيئتها الأصلية عن طريق الفحص المجهري البؤري. للقيام بذلك، يتم تلوين أقسام الأنسجة لعلامات من أنواع الخلايا متعددة جنبا إلى جنب مع وصمة عار السيتوكين. مفتاح هذه الطريقة، يتم حظر إفراز السيتوكين مباشرة في الجسم الحي قبل حصاد أنسجة الاهتمام، مما يسمح للكشف عن السيتوكين التي تراكمت داخل الخلايا المنتجة. مزايا هذا الأسلوب متعددة. أولاً، يتم الحفاظ على البيئة الدقيقة التي يتم فيها إنتاج السيتوكينات، والتي يمكن أن تبلغ في نهاية المطاف عن الإشارات المطلوبة لإنتاج السيتوكين والخلايا المتأثرة بتلك السيتوكينات. وبالإضافة إلى ذلك، يعطي هذا الأسلوب مؤشرا على موقع إنتاج السيتوكين في الجسم الحي، كما أنها لا تعتمد على إعادة تحفيز الخلايا المنتجة في المختبر. ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن في وقت واحد تحليل إشارات السيتوكين المصب في الخلايا التي تتلقى السيتوكين. وبالمثل، فإن إشارات السيتوكين التي لوحظت لا تتوافق إلا مع النافذة الزمنية التي تم خلالها حظر إفراز السيتوكين. في حين أننا نصف التصور من السيتوكين إنترفيرون (IFN) غاما في الطحال بعد عدوى الماوس من قبل البكتيريا داخل الخلايا الليستيريا monocytogenes، يمكن أن يكون هذا الأسلوب يحتمل أن تتكيف مع التصور من أي السيتوكين في معظم الأعضاء.
Introduction
تنسيق استجابة مناعية فعالة ضد مسببات الأمراض يتطلب التكامل المعقد للإشارات التي تعرضها مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية التي غالبا ما تنتشر بين الكائن الحي. من أجل التواصل، تنتج هذه الخلايا بروتينات صغيرة قابلة للذوبان مع وظائف بيولوجية متعددة تعمل كمعناتي يسمى السيتوكينات. Cytokines السيطرة على تجنيد الخلايا، وتفعيل وانتشار وبالتالي من المعروف أن تكون اللاعبين الرئيسيين في تعزيز الاستجابات المناعية1. تتطلب الاستجابات المناعية الفعالة إطلاق السيتوكينات في نمط spatiotemporal منظم جداً يربط خلايا محددة للحث على إشارات محددة. ولذلك، من الأهمية بمكان دراسة إنتاج السيتوكين وإشاراته في الموقع، مع مراعاة البيئة الدقيقة التي يتم فيها إنتاج السيتوكينات.
الليستيريا أحادية الخلايا (L. monocytogenes)هو بكتيريا داخل الخلايا إيجابية الجرام تستخدم كنموذج رئيسي لدراسة الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض داخل الخلايا في الفئران. يتم إنتاج واحدة السيتوكين، IFN غاما (IFNγ) بسرعة، في غضون 24 ساعة بعد عدوى L. monocytogenes. فمن الضروري لإزالة مسببات الأمراض، والفئران خرج لIFNγ هي عرضة للغايةللعدوى L. monocytogenes 2. IFNγ هو pleiotropic وتنتجها خلايا متعددة بعد العدوى3. في حين أن IFNγ التي تنتجها الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) مطلوبة للنشاط المباشر المضاد للبكتيريا4، فقد ثبت IFNγ من مصادر أخرى أن لديها وظائف أخرى. في الواقع، وجدنا نحن وآخرين مؤخرا أن IFNγ التي تنتجها خلايا CD8 + T لديه وظيفة محددة في تنظيم مباشرة T خلية التمايز5،6،7. وعلى هذا النحو، فإن فهم الخلايا التي تنتج هافنج (والبيئة الدقيقة) أمر بالغ الأهمية لتشريح وظيفتها.
التقنية الأكثر شيوعا لدراسة إنتاج السيتوكين يعتمد على تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا التي تم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بالكشف المتزامن عن السيتوكينات المتعددة جنبا إلى جنب مع علامات سطح الخلية داخل عينة واحدة، وتوفير أداة مفيدة للغاية لدراسة إنتاج السيتوكين. ومع ذلك، فإن استخدام التقنية المذكورة أعلاه يعني فقدان أي معلومات مكانية. وبالإضافة إلى ذلك، غالباً ما يعتمد الكشف عن السيتوكين على إعادة التحفيز في المختبر لتمكين الكشف عن السيتوكين. على هذا النحو ، يتم تحليل قدرة خلية معينة لإنتاج السيتوكين ، وأنها لا ترتبط بالضرورة مع إفراز السيتوكين الفعلي في الموقع. طرق أخرى استخدام الفئران مراسل الذي يرتبط التعبير البروتين الفلورسنت مع النسخ السيتوكين ويسمح للتصور على مستوى خلية واحدة8. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن تتبع النسخ السيتوكين في الموقع، وهناك عدد محدود من الفئران السيتوكين مراسل المتاحة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون النسخ والترجمة وإفراز في بعض الأحيان غير مرتبطة، والبروتينات الفلورية لها نصف عمر مختلف من السيتوكين أنها تقرير، مما يجعل هذه الطريقة في بعض الأحيان غير كافية لالتصور السيتوكين في الموقع.
هنا، ونحن نصف طريقة لتصور في الموقع إنتاج السيتوكين عن طريق الفحص المجهري البؤري في قرار خلية واحدة. هذه التقنية تمكن من تصور المصدر الخلوي ومحراب المحيطة داخل الأنسجة. يصف هذا البروتوكول على وجه التحديد التصور لإنتاج IFNγ في طحال الفئران المصابة L. monocytogenes، مع التركيز هنا على إنتاج IFNγ بواسطة خلايا NK ومستضد CD8+ T خلايا محددة. ومع ذلك، فإنه يمكن تمديدها وتكييفها مع توصيف أي إنتاج السيتوكين في سياق الحالات الأخرى التي يتم فيها إنتاج السيتوكينات مثل العدوى أو الالتهاب أو أمراض المناعة الذاتية، طالما يمكن الاحتفاظ السيتوكين المستهدف في الخلايا بواسطة مثبطات نقل البروتين داخل الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، نقدم طريقة لتصور إنتاج IFNγ في الطحال بعد عدوى L. monocytogenes في الفئران. هذا البروتوكول بسيط ويمكن تكييفه مع الأنسجة الأخرى ومشغلات السيتوكين، ولكن يجب النظر في الجوانب التالية. الخلايا في كثير من الأحيان تفرز بسرعة السيتوكينات التي تنتجها، ويتم التقاط السيتوكينات بسرعة من قبل الخلايا المجاورة. ومن الصعب على هذا النحو الكشف عن السيتوكينات في الموقع. وهناك طريقة شائعة لإعادة البدء بسرعة إنتاج السيتوكين هو إعادة تحفيز الخلايا في الجسم الحي السابق تليها الكشف عن السيتوكين في وسائل الإعلام عن طريق اختبار المناعية المرتبطة بالإنزيم. وفي هذا السياق، تُفقد أية معلومات عن التوطين المكاني للخلايا المنتجة للسيتوكين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إنتاج السيتوكين بعد إعادة التحفيز لا يعكس بالضرورة ما إذا كان يتم إنتاج السيتوكينات وإفرازها في الجسم الحي، بل يشير إلى قدرة مجموعة معينة من الخلايا على إنتاج السيتوكينات. ولذلك، فإن كلا الأسلوبين سيوفر معلومات مختلفة، وينبغي للمرء أن ينظر في المعلومات الأكثر قيمة لتجربتهما.
من أجل الكشف عن السيتوكينات داخل الخلايا، تستخدم طريقتنا مثبط نقل البروتين داخل الخلايا لاعتراض السيتوكينات داخل الخلايا وزيادة الكشف عن الإشارة. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن هذه المثبطات تؤثر على النقل الطبيعي للبروتينات من الشبكية البطانية (RE) إلى جهاز غولجي وإلى الحويصلة السرية التي تعوق إطلاقها، والتي يمكن أن تسبب سمية. ونتيجة لذلك، ينبغي استخدام BFA، أو مثبطات أخرى، لفترة قصيرة من الزمن، وعادة ما لا تزيد عن بضع ساعات. وبالتالي، من المهم العثور على التوازن الصحيح بين جرعة المانع ووقت العلاج من أجل تحسين مستوى السيتوكينات المحاصرين داخل الخلية دون التسبب في آثار خطيرة السمية الخلوية. هذه المتغيرات يمكن أن تختلف بين السيتوكينات ومسار الإدارة لBFA. في نموذج العدوى لدينا، تم إدارة BFA داخل اقابي من أجل توفير تشتت الجهازية السريعة، ولكن يمكن أيضا أن يتم تسليمها عن طريق الوريد.
مثبطات نقل البروتين داخل الخلايا الأكثر استخداماً هي BFA، المستخدمة هنا، وmonensin (MN). وغالبا ما تستخدم هذه المثبطات بشكل غير واضح لتراكم ودراسة إنتاج السيتوكين ولكن لديهم اختلافات طفيفة في آليات عملها. MN يمنع نقل البروتينات داخل جهاز غولجي وبالتالي تراكم البروتينات في Golgi17 في حين يمنع BFA بروتين coatomer معقدة-I التوظيف، مما يحول دون حركة الرجعية من البروتينات إلى الشبكية endoplasmic (ER) وبالتالي تعزيز تراكم السيتوكينات في ER18. وعلى هذا النحو، فإن اختيار أفضل مثبط نقل البروتين داخل الخلايا يعتمد على عوامل مختلفة، مثل السيتوكين الذي سيتم اكتشافه. على سبيل المثال، وقد تبين في تلطيخ الخلايا الداخلية التي يسببها lipopolysaccharide من الخلايا الأحادية أن BFA هو أكثر كفاءة لقياس السيتوكينات IL-1β، IL-6 و TNF من MN19.
وينطوي هذا البروتوكول على تصور السيتوكين في الموقع عن طريق الفحص المجهري البؤري، وبالتالي لا يوجد سوى عدد محدود من العلامات مما يمكن استخدامه لدراسة الخلايا المنتجة للسيتوكين وبيئتها الدقيقة. ومن الضروري أيضا أن تنظر في أن مثبطات نقل البروتين مثل BFA أو MN تعكر صفو التعبير الطبيعي للعديد من البروتينات وبالتالي استخدامها عند دراسة التعبير المتزامن لبعض علامات سطح الخلية التنشيط يجب أن اقترب عنايه. على سبيل المثال، BFA ولكن ليس MN كتل التعبير عن CD69 في الخلايا الليمفاوية المورين20. على الرغم من هذا القيد، التصوير البؤري يتيح توطين السيتوكينات دون الخلوية، فضلا عن اتجاه إفراز السيتوكين داخل الخلية. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول تشير إلى أن خلايا NK تميل إلى إفراز IFN-y في نمط منتشر في حين يبدو أن خلايا CD8+ T لتوجيه إفراز IFNγ نحو خلايا CD8+ T الأخرى التي هي في تفاعل مباشر معهم5.
وفي الختام، فإن هذا البروتوكول مناسب لتصور مجموعة متنوعة من السيتوكينات في الموقع وتحديد الخلايا المنتجة وبيئتها الدقيقة بعد العديد من المحفزات مثل العدوى أو المناعة الذاتية. المعلومات التي تم الحصول عليها مفيدة لفهم أهمية التزامن المكاني في الجسم الحي لأنواع الخلايا المختلفة والسيتوكين التي تنتجها، اللازمة للاستجابة المناعية الفعالة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر موظفي مرفق التصوير التابع لمعهد كينيدي على المساعدة التقنية في التصوير. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من صندوق كينيدي الاستئماني (إلى A.G.)، ومجلس بحوث التكنولوجيا الأحيائية والعلوم البيولوجية (BB/R015651/1 إلى A.G.).
Materials
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |||
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |||
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |||
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |||
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |||
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |||
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml | ||
| Microscope slides – Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |||
| anti-CD169 – AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
||
| anti-F4/80 – APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
||
| anti-B220 – PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
||
| anti-IFNg – biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml | ||
| anti-IFNg – BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
||
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml | ||
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Streptavidin – PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
||
| streptavidin – FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |||
| Cover glasses 22x40mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |||
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |||
| Imaris – Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||||
| Confocal microscope – Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||||
| Cryostat – CM 1900 UV | Leica | ||||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |||
| PBS 1X | Life Technologies Ltd | 20012068 | |||
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |||
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||||
| Insulin syringe, with needle, 29G | VWR International | BDAM324824 | |||
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
Referencias
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
