Sperm skal med held navigere gennem ovikanalen for at gøde en oocyte. Her beskriver vi en analyse til måling af sædmigration inden for C. elegans hermafrodit livmoderen. Denne analyse kan give kvantitative data om sædfordelingen i livmoderen efter parring, samt om hastighed, retningsbestemt hastighed, og reversering frekvens.
Vellykket befrugtning er grundlæggende for seksuel reproduktion, men kun lidt er kendt om de mekanismer, der fører sperm til oocytter i den kvindelige reproduktive tarmkanalen. Mens in vitro undersøgelser tyder på, at sperm af internt befrugtende dyr kan reagere på forskellige stikord fra deres omgivelser, den manglende evne til at visualisere deres adfærd inde i den kvindelige reproduktive tarmkanalen skaber en udfordring for forståelsen sperm migration og mobilitet i det oprindelige miljø. Her beskriver vi en metode ved hjælp af C. elegans , der overvinder denne begrænsning og udnytter deres transparente epidermis. C. elegans mænd plettet med en mitokondrie farvestof er parret med voksne hermaphrodites, der fungerer som modificerede hunner, og deponere optælling mærket sperm i hermafrodit livmoderen. Migrationen og motiliteten af den mærkede sperm kan derefter spores direkte ved hjælp af et EPI-fluorescens mikroskop i et levende hermaphrodite. I vild-type dyr, ca 90% af den mærkede sperm kravle gennem livmoderen og nå befrugtning stedet, eller spermatheca. Billeder af livmoderen kan tages 1 h efter parring for at vurdere fordelingen af sædcellerne i livmoderen og den procentdel af sædceller, der har nået spermatheca. Alternativt kan time-lapse billeder tages umiddelbart efter parring for at vurdere sædhastighed, retningsbestemt hastighed og reversering frekvens. Denne metode kan kombineres med andre genetiske og molekylære værktøjer til rådighed for C. elegans at identificere nye genetiske og molekylære mekanismer, der er vigtige i reguleringen af sperm vejledning og motilitet i den kvindelige reproduktive tarmkanalen.
De molekylære mekanismer, som spermatozoer (benævnt sperm) navigere gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen mod oocyt er ikke godt forstået, men er grundlæggende for seksuel reproduktion. Sperm motilitet er meget dynamisk og afhænger af robuste kommunikationssignaler, der ændrer sædhastigheden og retningsbestemt motilitet1,2,3,4,5,6 , 7 af , 8 ud af , 9 ud af , 10 stk. , 11 af , 12. C. elegans er blevet en kraftfuld model for at studere sædbevægelse in vivo, fordi hermaphrodite gennemsigtige epidermis tillader sporing af levende sperm ved enkelt celle opløsning2,3, 8,10. Formålet med dette dokument er at give metoder til vurdering af sædbevægelser inden for C. elegans hermafrodit livmoderen.
I dyrearter, hvor sperm og oocyt mødes i det ydre miljø (dvs., elementers vandløbs miljøer), sædceller reagere på chemotaktiske signaler udskilles af oocytter. Disse signaler guide retningen af sædceller bevægelse, bringe dem tættere på signalkilde4,6,11. Men, meget mindre er kendt om sperm bevægelse i arter, der gøder internt. En stor udfordring er arkitekturen i den kvindelige reproduktive tarmkanalen, som er utilgængelige for mikroskopi i de fleste arter. In vitro undersøgelser hos mennesker, mus og grise, for eksempel, giver dokumentation for, at subpopulationer af sædceller kan reagere på chemoattraktanter, fluid flow, og termiske gradienter1,5,7,9, 12. i. Med disse systemer, manglende evne til at visualisere og spore sperm bevægelse in vivo placerer alvorlige begrænsninger på strategier til at opdage de centrale mekanismer, der regulerer disse funktioner.
For at overvinde disse begrænsninger, har vi udviklet metoder ved hjælp af fyrretræsnematoden C. elegans til direkte visualisere sædceller efter insemination, til at måle individuelle sperm migration parametre in vivo, og til at måle evnen af en sædpopulation til at målrette fertiliserings stedet. Disse metoder, sammen med C. elegans molekylære og genetiske værktøjsæt, lette opdagelsen af de kemiske signalering molekyler og molekylære maskiner, der regulerer sperm motilitet adfærd. For eksempel kan genetiske skærme udføres i hermafroditter eller hanner til at identificere gener, der er afgørende for effektiv sædbevægelse in vivo13. Molekyler kan injiceres i hermafrodit gonad til at teste for effekter på sperm aktivering, migration hastighed, og retningsbestemt motilitet3. Derudover, de beskrevne metoder kan bruges til at overvåge rogue sperm migration i ektopisk krop steder og til at evaluere sperm konkurrence10,14.
C. elegans findes i naturen som hermafroditter og hanner (Se figur 1). Den hermafrodit gonad har to U-formede arme, der er spejlbilleder af hinanden. I L4-larvestadiet gennemgår de mest proximale kimceller (dvs. cellerne i nærheden af spermatheca) spermatogenesen. Hver primær spermatocyte kommer ind i meiose og producerer fire haploide spermatider. Disse spermatider er skubbet ind i spermatheca sammen med den første modne oocyt og undergår spermiogenesis15. Voksne hermafroditter skifte fra spermatogenesen til oogenesis. Oocytterne modnes i en samlebånds mode langs gonaden, med den mest modne oocyt i den proximale ende af gonaden, ved siden af spermatheca. MSP-signaler fra sæden er nødvendig for at udløse meiotisk modning og ægløsning16,17. Mand C. elegans, på den anden side, har en J-formet gonad, der producerer kun sperm. Spermatiderne opbevares i den skelsættende vesikel. Efter parring med hermafrodit eller kvinde, den mandlige indsætter Splinter nær halen i vulva. Spermatider aktiveres under sædafgang, når de kommer i kontakt med sædvæsken18. C. elegans sperm ikke svømme, da de ikke er flagelleret. I stedet, de kravle gennem reproduktions vejene, ved hjælp af pseudopod for bevægelse. Det er veletableret, at mandlige sædceller, som er større i størrelse, har en konkurrencemæssig fordel i forhold til hermafrodit sperm14.
I denne metode fungerer mandlige C. elegans som sæddonor og er parret med voksne hermaprhodites. Voksne hanner er plettet med en fluorescerende mitokondriel farvestof til produceret mærket sperm. Når deponeret gennem hermafrodit vulva, skal sæden kravle rundt om embryonerne i livmoderen mod spermatheca, eller befrugtning site. Den gennemsigtige epidermis af C. elegans model giver mulighed for direkte visualisering af hver enkelt sædceller, da det navigerer gennem den kvindelige reproduktive tarmkanalen. I de seneste år har vores laboratorium med succes brugt denne metode til at demonstrere vigtigheden af en klasse af F-serien prostaglandiner i ledende sperm fra vulva til spermatheca19,20. De molekylære mekanisim, der styrer dens syntese af hermafrodit og reaktionen fra sædcellerne, er stadig under efterforskning. Men denne metode til vurdering af sperm motilitet og migration i høj grad letter identifikationen af de vigtigste aktører, der kontrollerer sperm og oocyt kommunikation i internt befrugtning dyr. Følgende protokol beskriver trin for trin, hvordan du udfører denne analyse.
Evnen af sperm til at navigere den indviklede kvindelige reproduktive tarmkanalen og finde oocytter er afgørende for seksuel reproduktion. Nylige undersøgelser ved hjælp af sperm af internt befrugtende dyr tyder på, at de aktivt reagerer på forskellige Miljøsignaler, herunder kemisk signal, fluid flow, og temperaturgradienter1,5,7, 9 ud af , 12. disse observationer er dog stort set resultatet af in vitro eksperimenter og lidt vides om sædadfærd og kommunikation i reproduktions vejene. En af de største hindringer for at erhverve in vivo-data om sædmigration og motilitet er den manglende synlighed i de fleste kvindelige reproduktions skrifter. Den metode, vi har beskrevet her ved hjælp af C. elegans overvinder denne begrænsning. Som de repræsentative resultater demonstrere, den gennemsigtige epidermis giver mulighed for direkte visualisering og sporing af hver sædceller ved enkelt celle opløsning i en levende, intakt organisme.
C. elegans har to køn. Hannerne, med en XO genotype, producerer kun sperm, og i denne metode, der anvendes som sæddonorer. Hermaphrodite, med en XX genotype, er modificeret hunner. Deres gonader gennemgår først spermatogenesen under den fjerde larve fase og skifter til oogenesis i voksenalderen25. Denne analyse bruger voksne hermaphrodites, hvis reproduktive væv giver en model for den kvindelige reproduktive tarmkanalen. Udnyttelsen af begge køn i denne analyse giver os mulighed for at identificere genetiske og molekylære veje i både den mandlige og kvindelige, der kan regulere sperm vejledning og motilitet. Kombineret med hele væld af genetiske og molekylære teknikker til rådighed for C. elegans, denne metode kan føre til nye indblik i sædkvalitet migration og motilitet samt sperm og oocyt kommunikation.
Et par kritiske skridt i denne protokol berettiger yderligere overvejelse, ud over de oplysninger, der er fastsat i protokollen afsnit.
Orme
Fog-2 (q71), him-5 (e1490)eller him-8 (e1489) mutant hanner kan anvendes i stedet for N2 mænd. Disse mutationer øger hyppigheden af mænd i kulturer, men påvirker ikke mandlig parring eller sperm funktioner13. Kvinder, såsom tåge-2 (q71) kvinder, kan anvendes i stedet for hermaphrodites. Men, hunnerne skal være præ-parret med mænd til at tillade ordentlig oocyt udvikling. Tilstedeværelsen af befrugtede embryoner fra denne præ-parring sikrer også, at livmoderen er lang nok til korrekt vurdering sædfordelingen. Hvis mutant eller eksperimentelle hermafroditter er ved at blive vurderet, omfatte en kontrolgruppe (r). For eksempel bør mutant hermafroditter kombineres med dværg N2 hermafroditter som en kontrol for andre variabler i analysen. Hermaphrodites, der er blevet fodret med bakterier, der indeholder plasmider til RNA-interferens analyser, bør også fodres med bakterier, der indeholder Tom vektorkontrol. Afstanden fra vulva, hvor sperm er inseminated, at spermatheca, gødskning stedet, kan variere afhængigt af antallet af æg i livmoderen (dvs., livmoderen udvider med stigende ægnummer). Hvis der foretages sammenligninger mellem genotyper, skal du vælge hermafroditter, hvis uteri indeholder lignende antal æg. Undlad at vælge hermafroditter, der indeholder ruge embryoner eller bevægende larver. En tid kursus kan udføres for at identificere den optimale alder, hvor hermafroditter bør analyseres.
Picking hermafroditter og hanner
Det er vigtigt, at hermafroditter plukket til denne analyse er ikke fra over groede eller sultede plader. Mad og feromon stikord modulere udtrykket af DAF-7, en TGFß homolog. DAF-7 pathway er blevet vist regulere syntesen af F-serien prostaglandiner, der spiller vigtige roller i at vejlede sperm til spermatheca20. Picking hermafroditter fra overfyldte eller sultede plader kan resultere i dårlig sperm vejledning ikke er relateret til målet af interesse. Tætheden af pladerne synes ikke at påvirke den mandlige sædceller. Men, mænd, der er for ung eller for gammel kan resultere i nedsat parring effektivitet (dvs., procentdelen af hermafroditter på parring plade, der har nok sperm i deres uteri at kvantificere). 1-3 dag gamle voksne mænd er optimale til denne analyse23.
Anæstetiserende hermafroditter
I vores hænder sikrer Tetramisole-og Tricaine-kombinationen, at orme er immobiliseret og forbliver i live under parring og billed erhvervelse. Andre anæstetika, såsom natrium Azid, kan også anvendes. Men, natrium Azid er meget giftigt og betingelser skal være standardiseret. Immobiliserings teknikker ved hjælp af mikroperler, agopstået, og microfluidics kamre anbefales ikke, da de forstyrrer parring.
Mandlig farvning
Den Mito-farve, der anvendes i dette manuskript, MitoTrackerCMXRos, har været meget anvendt til mærkning af sperm, samt andre mitokondrier, i C. elegans. Den sperm mærket med denne Mito-Dye er fuldt funktionel, bevarer sin evne til at blive aktiveret, migrere, gøde oocytter, og producere levedygtige afkom26,27. Andre mitokondrie farvestoffer, såsom rhodamin 6G og DiOC6 er blevet brugt til at plette C. elegans mitokondrier28,29. Men, betingelser for disse farvestoffer skal være standardiseret for mærkning sperm i denne analyse. Ud over mitochrondrial mærknings mekanismer, kan DNA-pletter, såsom Syto17, også bruges til at mærke sperm for migration analyser30. Mens disse mærknings teknikker er relativt nemme og hurtige at udføre, kan transgene strategier også anvendes til at generere sperm, der udtrykker fluorescerende Tags under sperm specifikke promotorer31,32.
Parring
Parring af prikker, der er for tykke, kan reducere parnings effektiviteten. Der bør udvises forsigtighed for at overføre så lidt bakterier som muligt, når du flytter hanner og bedøvet hermafroditter på parring prik.
Fremstilling af betrækket puder og anbringelse af Cover sedlen
Luftbobler kan genereres i agopstået puder. De kan refragere lys under billed erhvervelse eller, når den er stor nok, forårsage orme til at falde igennem, hvilket gør det umuligt at erhverve billedet (r). På samme måde kan der dannes luftbobler langs hermaphroditterne, når Cover sedlen anbringes over dem på agopstået pad. Disse bobler afbøje lys og føre til nedsat billedkvalitet. Øvelse vil hjælpe med at mindske forekomsten af luftbobler.
Kvantificering
Ved kvantificering af sædfordelingen kan forskellige z-fly gennem livmoderen i en orm have små forskelle i sædfordelingen. Vi finder, at tage et enkelt billede fokuseret på spermatheca giver os reproducerbare resultater, der svarer til resultater opnået ved at gennemsnit flere z-sektioner. Vi anbefaler at fokusere billedet på midten af spermatheca, men de brændings planer kan ændres lidt baseret på experimenter behov. Det er imidlertid afgørende, at alle billeder tages på samme måde. Desuden er det vigtigt, at kun sædceller, der er i fokus, tælles. Det er modparts skøn ved fastlæggelsen af kriterierne for in-Focus sædceller. Det er imidlertid afgørende, at kriterierne anvendes systematisk på hver enkelt orm, der er kvantificeret. For sædsporing, mange software tilbyder automatisk tracking kapaciteter. Men vi finder, at manuel tracking outudfã ̧rer softwarens automatiske sporings algoritme af to hovedårsager: 1) den overflod af tilsvarende størrelse kerner inden for det lukkede rum gør det vanskeligt for softwaren at skelne mellem individuelle sædceller og oprette definerede ROIs for hver sædcelle. 2) som sperm gå ind og ud af fokus, deres intensiteter Skift, hvilket gør det vanskeligt for softwaren at holde styr på sædcellerne over længere perioder.
The authors have nothing to disclose.
Vi oprigtigt takke vores afdøde mentor, Dr. Michael Miller, for hans inspirerende og uselviske mentorskab og skabelse af denne metode som et værktøj til bedre at forstå sperm og oocyt kommunikation. Hans pludselige død har været et enormt tab for hans familie, hans laboratorium, og det videnskabelige samfund. Denne undersøgelse blev støttet af NIH (R01GM085105 til MAM og F30HD094446 til MH). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.
Reagents and Material | |||
60mm x 15mm Petri Dish | Fisher | FB0875713A | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
N2 | CGC | N2 | |
fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
Platinum wire 0.25mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
Watch glass | Fisher | 02-612A | |
5mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20°C |
Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20°C. |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20°C |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
16°C and 20°C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |