Sperm må kunne navigere gjennom oviduct for å gjødsle en oocyte. Her beskriver vi en analyse for å måle sperm migrasjon innenfor C. elegans Hermafroditt livmoren. Denne analysen kan gi kvantitative data på sperm distribusjon i livmoren etter mating, samt på hastighet, retningsbestemt hastighet, og reversering frekvens.
Vellykket befruktning er grunnleggende for seksuell reproduksjon, men lite er kjent om mekanismene som veileder sperm til oocytter innenfor den kvinnelige reproduktive tarmkanalen. Mens in vitro studier tyder på at sperm av internt gjødsling dyr kan svare på ulike signaler fra sine omgivelser, den manglende evne til å visualisere sin atferd inne i kvinnelige reproduktive tarmkanalen skaper en utfordring for å forstå sperm migrasjon og mobilitet i sitt opprinnelige miljø. Her beskriver vi en metode som bruker C. elegans som overvinner denne begrensningen og utnytter deres gjennomsiktige epidermis. C. elegans hanner beiset med en mitokondrie fargestoff er paret med voksen hermafroditter, som fungerer som modifiserte kvinner, og innskudd fluorescensmerkete merket sperm inn i Hermafroditt livmoren. Migrasjon og motilitet av merket sperm kan deretter spores direkte ved hjelp av et Epi-fluorescens mikroskop i en live Hermafroditt. I vill-type dyr, ca 90% av merket sperm krype gjennom livmoren og nå befruktning området, eller spermatheca. Bilder av livmoren kan tas 1 time etter mating for å vurdere fordelingen av sperm i livmoren og prosentandelen av sæd som har nådd spermatheca. Alternativt kan time-lapse bilder tas umiddelbart etter mating for å vurdere sperm hastighet, retningsbestemt hastighet og reversering frekvens. Denne metoden kan kombineres med andre genetiske og molekylære verktøy tilgjengelig for C. elegans å identifisere romanen genetiske og molekylære mekanismer som er viktige i å regulere sperm veiledning og motilitet innenfor den kvinnelige reproduktive tarmkanalen.
Den molekylære mekanismer som spermatozoa (referert til som sperm) navigere gjennom den kvinnelige reproduktive tarmkanalen mot oocyte er ikke godt forstått, men er grunnleggende for seksuell reproduksjon. Sperm motilitet er svært dynamisk og avhenger av robust kommunikasjon signaler som endrer sperm hastighet og retningsbestemt motilitet1,2,3, 4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12. C. elegans har blitt en kraftfull modell for å studere sperm bevegelse i vivo fordi Hermafroditt gjennomsiktige epidermis tillater sporing av levende sperm på én celle oppløsning2,3, 8,10. Hensikten med dette papiret er å gi metoder for å vurdere sperm bevegelse i C. elegans Hermafroditt livmoren.
I dyrearter hvor sperm og oocyte møtes i det ytre miljø (dvs. acquatic miljøer), sperm svare på chemotactic signaler skilles ut av oocytter. Disse signalene guide retning sperm bevegelse, bringe dem nærmere signalkilden4,6,11. Men mye mindre er kjent om sperm bevegelse i arter som gjødsle internt. En stor utfordring er arkitekturen i den kvinnelige reproduktive kanalen, som er utilgjengelig for mikroskopi i de fleste arter. I vitro studier hos mennesker, mus og griser, for eksempel, gir bevis for at subpopulasjoner av sperm kan svare på chemoattractants, væskeflyt, og termisk graderinger1,5,7,9, det er 12. Med disse systemene, manglende evne til å visualisere og spore sperm bevegelse in vivo steder alvorlige begrensninger på strategier for å oppdage de viktigste mekanismene som regulerer disse funksjonene.
For å overkomme disse begrensningene har vi utviklet metoder som bruker nematode C. elegans til å visualisere sperm direkte etter befruktning, for å måle individuelle overførings parametre for sperm i Vivo, og for å måle evnen til en sæd befolkning til å målrette befruktning området. Disse metodene, sammen med C. elegans molekylær og genetisk verktøysett, lette oppdagelsen av den kjemiske signalering molekyler og molekylære maskiner som regulerer sperm motilitet atferd. For eksempel, genetisk skjermene kan gjennomført inne hermafroditter eller hanndyr å identifisere gener det er vesentlige for effektiv sperm bevegelse inne vivo13. Molekyler kan injiseres inn i Hermafroditt gonad å teste for effekter på sperm aktivering, migrasjon hastighet, og retningsbestemt motilitet3. I tillegg kan de beskrevne metoder brukes til å overvåke rogue sperm migrasjon i utenfor livmoren kroppen steder og å evaluere sperm konkurranse10,14.
C. elegans finnes i naturen som hermafroditter og hanner (se figur 1). Den Hermafroditt gonad har to U-formede armer som er speil bilder av hverandre. Under L4 larvestadiet scenen, den mest proksimale bakterieceller (dvs. cellene i nærheten av spermatheca) gjennomgår spermatogenesis. Hver primære spermatocyte inn meiose og produserer fire haploide via. Disse via skyves inn i spermatheca sammen med de første modne oocyte og gjennomgår spermiogenesis15. Voksen hermafroditter bytte fra spermatogenesis til oogenese. Oocytter modnes i en samlebånd mote langs gonad, med de mest modne oocyte ved proksimale enden av gonad, ved siden av spermatheca. MSP signaler fra sperm er nødvendig for å utløse meiotic modning og ovulation16,17. Mann C. elegans, derimot, har en J-formet gonad som produserer bare sperm. Via er lagret i den banebrytende vesicle. Ved mating med Hermafroditt eller hunn, den mannlige setter inn spiklene nær halen inn i snappe. Via aktiveres under utløsning, når de kommer i kontakt med sædvæsken18. C. elegans sperm ikke svømme som de ikke er pisket. I stedet gjennomgår de gjennom reproduktive tarmkanalen, ved hjelp av fingeraktige for bevegelse. Det er godt etablert at mannlige sperm, som er større i størrelse, har et konkurransefortrinn over Hermafroditt sperm14.
I denne metoden, mannlige C. elegans opptre som sperm donor og er paret med voksen hermaprhodites. Voksne hanner er farget med et fluorescerende mitokondrie fargestoff til produsert merket sperm. Når avsatt gjennom Hermafroditt snappe, må sperm krype rundt embryo i livmoren mot spermatheca, eller befruktning området. Den gjennomsiktige epidermis av C. elegans modellen gjør det mulig for direkte visualisering av hver enkelt sperm som den navigerer gjennom den kvinnelige reproduktive tarmkanalen. I de senere årene, har vår Lab med hell brukt denne metoden til å demonstrere viktigheten av en klasse av F-serien prostaglandiner i guiding sperm fra snappe til spermatheca19,20. Den molekylære mechansims styrende sin syntese av Hermafroditt og respons av sperm er fortsatt under etterforskning. Men denne metoden for å vurdere sperm motilitet og migrasjon forenkler identifisering av de viktigste aktørene som kontrollerer sperm og oocyte kommunikasjon i internt gjødsling dyr. Følgende protokoll beskriver trinn for trinn hvordan du utfører denne analysen.
Evne til sperm til å navigere i convoluted kvinnelige reproduktive tarmkanalen og finne oocytter er avgjørende for seksuell reproduksjon. Nyere studier ved hjelp av sperm av internt gjødsling dyr foreslår de aktivt svare på ulike miljømessige signaler, inkludert kjemiske signaler, Fluid Flow, og temperatur graderinger1,5,7, 9 andre priser , 12. men, disse observasjonene har i stor grad resultert fra in vitro eksperimenter og lite er kjent om sperm atferd og kommunikasjon innen reproduktive tarmkanalen. En av de viktigste barrierene for å anskaffe in vivo data om sperm migrasjon og motilitet er mangelen på synlighet innenfor de fleste kvinnelige reproduktive traktater. Metoden vi har beskrevet her bruker C. elegans overvinner denne begrensningen. Som representative resultatene viser, gir den gjennomsiktige epidermis for direkte visualisering og sporing av hver sperm på én celle oppløsning i en levende, intakt organisme.
C. elegans har to kjønn. De menn, med en XO genotype, produserer bare sperm, og i denne metoden, brukes som sæddonorer. Hermafroditt, med en XX-genotype, er modifiserte hunner. Deres gonader først gjennomgå spermatogenesis under den fjerde larvestadiet scenen og bytte til oogenese i voksen alder25. Denne analysen bruker voksen hermafroditter, som reproduktive vev gir en modell for den kvinnelige reproduktive tarmkanalen. Utnyttelsen av begge kjønn i denne analysen tillater oss å identifisere genetiske og molekylære trasé i både mannlige og kvinnelige som kan regulere sperm veiledning og motilitet. Kombinert med hele rekke genetiske og molekylære teknikker tilgjengelig for C. elegans, denne metoden kan føre til romanen innsikt i sperm migrasjon og motilitet samt sperm og oocyte kommunikasjon.
Noen kritiske trinn i denne protokollen garanterer ytterligere vurdering, i tillegg til detaljene i protokollen delen.
Ormer
Fog-2 (Q71), HIM-5 (e1490), eller ham-8 (e1489) mutant hanner kan brukes i stedet for N2 hanner. Disse mutasjoner øke hyppigheten av menn i kulturer, men påvirker ikke mannlig mating eller sperm funksjoner13. Kvinner, som Fog-2 (Q71) kvinner, kan brukes i stedet for hermafroditter. Imidlertid, kvinner må være pre-paret med hanndyr å tillate lated oocyte utviklingen. Tilstedeværelsen av befruktet embryo fra denne pre-mating sikrer også at livmoren er lang nok til å vurdere sperm distribusjon. Hvis det vurderes mutant eller eksperimentell hermafroditter, ta med en kontrollgruppe (r). Mutant hermafroditter bør for eksempel pares med wildtype N2-hermafroditter som en kontroll for andre variabler i analysen. Hermafroditter som er matet med bakterier som inneholder plasmider for RNA forstyrrelser analyser bør også mates med bakterier som inneholder tomme vektor kontroll. Avstanden fra den snappe, hvor sperm er inseminert, til spermatheca, befruktning området, kan variere avhengig av antall egg i livmoren (dvs. livmoren utvides med økende egg nummer). Hvis sammenligninger mellom genotyper er gjort, Velg hermafroditter hvis uteri inneholder lignende antall egg. Ikke Velg hermafroditter som inneholder klekking embryo eller bevegelige larver. En tid kurs kan utføres for å identifisere den optimale alder hvor hermafroditter skal analyseres.
Plukking av hermafroditter og hanner
Det er viktig at hermafroditter plukket for denne analysen er ikke fra overgrodd eller sultet plater. Mat og feromon stikkord modulere uttrykk for DAF-7, en TGFß homologe. Den DAF-7 stien har blitt vist regulere syntesen av F-serien prostaglandiner som spiller viktige roller i guiding sperm til spermatheca20. Plukke hermafroditter fra overfylte eller sultet plater kan føre til dårlig sperm veiledning ikke er relatert til målet av interesse. Tettheten av platene ser ikke ut til å påvirke den mannlige sperm. Men menn som er for ung eller for gammel kan resultere i redusert paring effektivitet (dvs. prosent av hermafroditter på mating plate som har nok sperm i sine uteri å kvantifisere). 1-3 dag gamle voksne hanner er optimale for denne analysen23.
Anesthetizing hermafroditter
I våre hender, Tetramisole og Tricaine kombinasjonen sikrer at ormer er immobilisert, og holde seg i live under mating og bildeoppkjøp. Andre anestesimidler, slik som natrium Natriumazid, kan også brukes. Natrium Natriumazid er imidlertid svært giftig og forhold må være standardisert. Immobilisering teknikker bruker mikroperler, agarose, og materialer kamre er ikke anbefalt som de forstyrrer parring.
Mannlig farging
Den mito-Dye brukt i dette manuskriptet, MitoTrackerCMXRos, har vært mye brukt for merking sperm, så vel som andre mitokondrier, i C. elegans. Sæden merket med denne mito-Dye er fullt funksjonell, beholder sin evne til å være aktivert, migrere, gjødsle oocytter, og produserer levedyktig avkom26,27. Andre mitokondrie fargestoffer, slik som rhodamine 6G og DiOC6 har blitt brukt til å beis C. elegans mitokondrier28,29. Men, betingelser for disse fargestoffer må være standardisert for merking sperm i denne analysen. I tillegg til mitochrondrial merkings mekanismer, kan DNA-flekker, som Syto17, også brukes til å merke sæd for migrasjon analyser30. Mens disse merkingsteknikker er relativt enkle og raske å utføre, transgene strategier kan også være ansatt for å generere sperm som uttrykker fluorescerende koder under sperm bestemte arrangører31,32.
Parring
Mating prikker som er for tykke kan redusere paring effektivitet. Forsiktighet bør utvises for å overføre så lite bakterier som mulig når du overfører menn og anesthetized hermafroditter på mating prikk.
Making agarose pads og plassere dekselet slip
Luftbobler kan genereres i agarose pads. De kanskje brekker lyset i løpet av image oppkjøpet eller, når stor nok, anledning ormer å falle gjennom, gjør den utelukket å erverve bildet (). På samme måte kan luftbobler opprettes langs hermafroditter når deksel Seddelen plasseres over dem på agarose puten. Disse boblene brekker lys og føre til redusert bildekvalitet. Praksis vil bidra til å redusere forekomsten av luftbobler.
Kvantifisering
Når kvantifisere sperm distribusjon, ulike z-fly gjennom livmoren av en orm kan ha små forskjeller i sperm distribusjon. Vi finner at å ta et enkelt bilde fokusert på spermatheca gir oss reproduserbar resultater som ligner resultater oppnådd ved snitt flere z-seksjoner. Vi anbefaler å fokusere bildet på midten av spermatheca, men fokal flyene kan endres litt basert på eksperimentator behov. Det er imidlertid avgjørende at alle bildene er tatt på samme måte. Videre er det viktig at bare sperm som er i fokus telles. Det er telleren skjønn i å bestemme kriteriene for i-fokus sperm. Det er imidlertid avgjørende at kriteriene brukes systematisk for hver orm som er kvantifisert. For sæd sporing tilbyr mange programvare automatiske sporingsfunksjoner. Vi finner imidlertid at manuell sporing overgår programvaren automatisk sporing algoritme for to hovedgrunner: 1) overflod av lignende størrelse kjerner innenfor trange rom gjør det vanskelig for programvaren å skille mellom individuelle sperm og opprette definerte ROIs for hver sæd. 2) som sperm gå inn og ut av fokus, deres intensitet SKIFT, noe som gjør det vanskelig for programvaren å holde styr på sperm over lengre perioder.
The authors have nothing to disclose.
Vi oppriktig takker vår avdøde mentor, Dr. Michael Miller, for hans inspirerende og uselvisk mentorer og etablering av denne metoden som et verktøy for å bedre forstå sperm og oocyte kommunikasjon. Hans plutselige bortgang har vært et enormt tap for hans familie, hans laboratorium, og det vitenskapelige samfunnet. Denne studien ble støttet av NIH (R01GM085105 til MAM og F30HD094446 til MH). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Reagents and Material | |||
60mm x 15mm Petri Dish | Fisher | FB0875713A | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
N2 | CGC | N2 | |
fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
Platinum wire 0.25mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
Watch glass | Fisher | 02-612A | |
5mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20°C |
Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20°C. |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20°C |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
16°C and 20°C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |