İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme
Summary
Transkraniyal optik görüntüleme, canlı fareler korteks içinde sağlam bir kafatası ile beyin omurilik sıvı taşımacılığı geniş alan görüntüleme sağlar.
Abstract
Kemirgenlerde beyin omurilik sıvısı (CSF) akışı büyük ölçüde izleyiciler ex vivo ölçülme kullanılarak incelenmiştir. İki foton mikroskopisi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi teknikler, CSF akışının in vivo ölçümlemesini sağladı, ancak sırasıyla azaltılmış görüntüleme hacimleri ve düşük uzamsal çözünürlük ile sınırlıdır. Son çalışmalar, CSF ‘nin, kemirgen korteksinin pial ve penetran arterlerini çevreleyen perivasküler alanların ağ üzerinden beyin parankimesi girdiğini buldu. Bu perivasküler CSF girişi, glikmiyatik sistemin primer bir sürücüsüdür, toksik metabolik solakların (örn. amiloid-β) temizlenmesinden oluşan bir yol. Burada, floresan CSF izleyicilerini canlı farelerin bozulmamış kafatası ile gerçek zamanlı, mezoskopik görüntüleme sağlayan yeni bir makroskopik görüntüleme tekniği göstermektedir. Bu minimal invazif yöntem, çok sayıda deneysel tasarımı kolaylaştırır ve CSF dinamiklerinin tek veya tekrarlanan testlerini sağlar. Makroskoplar yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüğe sahiptir ve büyük Portal ve çalışma mesafesi davranışsal cihazlarda görev yaparken görüntüleme için izin verir. Bu görüntüleme yaklaşımı, bu teknikten elde edilen iki foton görüntüleme ve floresan ölçümleri ile güçlü bir şekilde ex vivo floresans ve radyo etiketli izleyicileri ölçmek ile ilişkilendirilir. Bu protokolde, canlı farelerde glymphatic taşımacılığı değerlendirmek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanılabilen olduğunu tarif ediyoruz, daha pahalı görüntüleme yöntemleri için erişilebilir bir alternatif sunuyor.
Introduction
Beyin omurilik sıvısı (CSF) beyinleri ve omuriliği yıkanır ve homeostaz bakımını, besin temini ve intrakranial basıncı düzenleyen1. Subaraknoid uzayda CSF perivasküler boşluklar bir ağ ile beyin girer (PVS) kortikal pial arterlerin çevreleyen ve sonra nüfuz arteriyoller boyunca aşağı akar2. Bir kez parankimat, interstisyel sıvı ile CSF değişimleri (ISF), düşük direnç beyaz madde yolları ve perivenöz alanlar ile beynin dışında amiloid β (Aβ) ve Tau protein agrega gibi zararlı metabolitleri taşıyan2,3 . Bu yol astroglial Aquaporin-4 (AQP4) kanallarına bağlıdır ve bu nedenle glial-lenfatik (glymphatic) sistemi4olarak adlandırılır. Nörofobik atık ürünleri sonunda kraniyal sinirlerin yakınındaki lenfatik damarlardan ve servikal lenf nodlarına doğru meninglerin üzerinden CSF-ıSF ‘ d a k i temizlenir5. Bu sistemin başarısızlığı, Alzheimer hastalığı6,7, travmatik beyin hasarı3, iskemik ve hemorajik inme8gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda karışmıştır.
CSF taşımacılığı, (cm)9,10 ve geçmişte glymphatic çalışmalar özellikle iki foton mikroskopisi4,11,12kullanılmış olan Cisterna içinde izleyicileri infaklama tarafından görselleştirilebilir 13, manyetik rezonans görüntüleme (MRG)14,15,16,17, ve ex vivo görüntüleme3,6,11, 18 . Tracer kinetiği değerlendirmek için. İki foton mikroskobu, PVSs ‘deki CSF izleyicileri ve yüksek uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak parankimat hakkında ayrıntılı görüntüleme için uygun bir yöntemdir, ancak dar bir bakış alanı vardır ve invaziv bir kafatası penceresi veya kafatası inceltme gerektirir. Ex vivo görüntüleme, immünhistokimya ile birlikte, tek hücrelerden tüm beyin19kadar çok düzeyli analizler sağlar. Ancak, post-mortem doku gözlemlemek için gerekli perfüzyon-fiksasyon süreci CSF akış yönünde derin değişiklikler üretir ve PVS daraltır, önemli ölçüde dağılımı ve izleyicinin konumunu değiştiren12. Son olarak, MRI tüm murine ve insan beyni boyunca CSF akışını izleyebilirken, perivasküler akışın uzamsal ve temporal çözünürlüğüne sahip değildir.
Yeni bir teknik, Transkraniyal makroskopik görüntüleme, canlı farelerin tüm dorsal korteks perivasküler CSF taşıma geniş alan görüntüleme sağlayarak bu sınırlamalar bazı çözer. Bu tür görüntüleme, Multiband filtre küpü, ayarlanabilir LED ışık kaynağı ve yüksek verimli CMOS Kamera10kullanarak bir epifloresan makrokapsam ile yapılır. Bu set-up 1-2 kadar PVSs çözmek edebiliyoruz kafatası yüzeyinin altında mm ve kortikal yüzeyin 5-6 mm kadar fluorophores tespit edebilir kafatası tamamen bozulmamış bırakarak10. Çok bantlı filtreler ve hızlı bir şekilde ayarlanabilir LED ‘Ler, CSF ‘nin aynı denemede farklı moleküler ağırlıklar ve kimyasal özelliklerin izleyicileri ile etiketlenmesine olanak tanıyan birden fazla fluorophorenin kullanımını sağlar.
Bu prosedür, kafatası ortaya çıkarmak için basit ve minimal invazif bir cerrahi gerektirir ve görüntüleme oturumu sırasında başını stabilize etmek için hafif bir baş plaka yerleştirin. İzleyiciler, kafatası delme veya pipetler veya kanüller ile kortikal doku penetran olmadan cm içine teslim edilebilir9,20. Hem CM kanüller hem de baş plakaları birkaç gün boyunca istikrarlı kalır ve klasik son nokta görselleştirmesine kıyasla daha karmaşık Deneysel tasarımlar kolaylaştırır. Bu protokol, floresan CSF izleyicilerin akut veya kronik enjeksiyonunu takiben anestezik/uyku veya uyanık farelerin CM ‘ye doğru, glikmiyatik sistem fonksiyonunu incelemek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ticari olarak mevcut floresan makroskopları ve izleyiciler kullanarak canlı farelerde Transkraniyal CSF görüntüleme yapmak için ayrıntılı bir protokol tarif ettik. Bu teknik basit ve minimal-invaziv, henüz nicel. In vivo görüntüleme, CM tesliminden sonra 3H-dextran ve 14C-inulin ve ex vivo koronal kesit ölçümü10‘ da dahil olmak üzere radyo etiketli izleyicileri sıvı scintbrilasyon sayımı gibi hassas yöntemlerle de ilişkilendirir. <sup class…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü nörolojik hastalıklar ve Inme ve Ulusal Enstitüsü yaşlanma (ABD Ulusal sağlığı Enstitüleri tarafından finanse edildi; R01NS100366 ve RF1AG057575-MN), Fondation Leducq transatlantik mükemmellik ağları programı ve AB Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (Grant No. 666881; SVDs @ Target). Biz de grafik çizimler ile uzman yardım için dan Xue teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
Referencias
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers – anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita, ., S, , et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run’ model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
