In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia
Summary
A imagem latente ótica de Transcranial permite a imagem latente do largo-campo do transporte do líquido cerebrospinal no córtice de ratos vivos através de um crânio intacto.
Abstract
O fluxo de líquido cefalorraquidiano (LCR) em roedores tem sido largamente estudado com quantificação ex vivo de Traçadores. As técnicas tais como a microscopia do dois-fotão e a imagem latente de ressonância magnética (MRI) permitiram in vivo a quantificação do fluxo do CSF mas são limitadas por volumes reduzidos da imagem latente e pela baixa definição espacial, respectivamente. O trabalho recente constatou que o LCR entra no parênquima cerebral através de uma rede de espaços perivasculares em torno das artérias piais e penetrantes do córtex do roedor. Esta entrada perivascular do CSF é um excitador preliminar do sistema glymphatic, um caminho implicado no afastamento de solutos metabólicos tóxicos (por exemplo, amyloid-β). Aqui, nós ilustramos uma técnica macroscópica nova da imagem latente que permita o tempo real, imagem latente mesoscópicos de traçadores fluorescentes do CSF através do crânio intacto de ratos vivos. Este método minimamente invasivo facilita uma infinidade de experimentos experimentais e permite o teste único ou repetido da dinâmica do LCR. Os macroscópios têm alta resolução espacial e temporal e seu grande pórtico e distância de trabalho permitem a criação de imagens durante a execução de tarefas em dispositivos comportamentais. Esta aproximação da imagem latente foi validada usando a imagem latente do dois-fotão e as medidas da fluorescência obtidas desta técnica correlacionam fortemente com a fluorescência ex vivo e a quantificação de Tracers rádio-etiquetados. Neste protocolo, nós descrevemos como a imagem latente macroscópica Transcranial pode ser usada para avaliar o transporte glymphatic em ratos vivos, oferecendo uma alternativa acessível às modalidades mais caras da imagem latente.
Introduction
O líquido cefalorraquidiano (LCR) Bane o cérebro e a medula espinhal e está envolvido na manutenção da homeostase, fornecendo nutrientes e regulando a pressão intracraniana1. O CSF no espaço subarachnoid entra no cérebro através de uma rede de espaços perivasculares (PVS) que cercam artérias pial corticais e flui então para baixo ao longo das arteríolas penetrantes2. Uma vez no parênquima, as trocas de LCR com fluido intersticial (ISF), transportando metabólitos nocivos como amiloide-β (aβ) e proteínas tau agregam fora do cérebro através de intervalos de matéria branca de baixa resistência e espaços perivenosos2,3 . Este caminho é dependente de astroglial Aquaporin-4 (AQP4) canais e, portanto, tem sido denominado o glial-linfático (glymphatic) sistema4. Os produtos waste do neurópilo são cancelados finalmente do CSF-ISF através dos vasos linfáticos perto dos nervos cranianos e nas meninges para fora para os nós de linfa cervicais5. A falha deste sistema foi implicada em diversas doenças neurológicas tais como a doença de Alzheimer6,7, ferimento de cérebro traumático3, e curso isquêmico e hemorrágico8.
O transporte do CSF pode ser visualizado pela infusão de traçadores na cisterna magna (cm)9,10 e os estudos glicmfáticos no passado utilizaram principalmente a microscopia de dois fótons4,11,12, 12, 13, ressonância magnética (RM)14,15,16,17e ex vivo Imaging3,6,11, 18 para avaliar a cinética do traçador. A microscopia do dois-fotão é um método apropriado para a imagem latente detalhada de traçadores do CSF nos PVSs e o parênquima devido a sua definição espacial elevada, entretanto, tem um campo de visão estreito e exige uma janela craniana invasora ou um afinamento do crânio. A imagem latente ex vivo, em combinação com Immunohistochemistry, permite análises multinível que variam das únicas pilhas até o cérebro inteiro19. No entanto, o processo de fixação da perfusão que é necessário para observar o tecido pós-morte produz profundas mudanças na direção do fluxo do LCR e colapsa o PVS, alterando significativamente a distribuição e a localização dos traçadores12. Finalmente, quando MRI puder controlar o fluxo do CSF durante todo o cérebro murino e humano inteiro, falta a definição espacial e temporal do fluxo perivascular.
Uma técnica nova, imagem latente macroscópica transcraniana, resolve algumas destas limitações permitindo a imagem latente do largo-campo do transporte perivascular do CSF no córtice dorsal inteiro de ratos vivos. Este tipo de imagem é feito com um Macroscópio epifluorescente usando um cubo de filtro multibanda, fonte de luz LED sintonável, e câmera CMOS de alta eficiência10. Estes set-ups são capazes de resolver PVSs até 1-2 mm abaixo da superfície do crânio e pode detectar fluoróforos até 5-6 mm abaixo da superfície cortical, deixando o crânio totalmente intacto10. Os filtros e os diodos emissores de luz Multiband que podem rapidamente ajustar o comprimento de onda da excitação permitem o uso de fluoróforos múltiplos permitindo que o CSF seja etiquetado com os traçadores de pesos moleculars e de propriedades químicas diferentes na mesma experiência.
Este procedimento requer uma cirurgia simples, minimamente invasiva para expor o crânio e colocar uma placa de cabeça de peso leve para estabilizar a cabeça durante a sessão de imagem. Os traçadores podem ser entregues no cm sem perfurar no crânio ou penetrar o tecido cortical com pipetas ou cânulas9,20. Ambas as cânulas CM e placas de cabeça permanecem estáveis por vários dias a semanas e facilitam projetos experimentais mais complexos em comparação com a visualização clássica do ponto final. Este protocolo descreve como a imagem latente macroscópica Transcranial é usada para estudar a função glymphatic do sistema que segue a injeção aguda ou crônica do Tracer fluorescente do CSF no CM de ratos anestesiados/dormindo ou acordados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um protocolo detalhado para executar a imagem latente Transcranial do CSF em ratos vivos usando macroscópios e traçadores fluorescentes comercialmente-disponíveis. Esta técnica é simples e minimamente invasiva, mas quantitativa. A imagem latente in vivo correlaciona bem com os métodos sensíveis tais como a contagem líquida do cintilação de traçadores rádio-etiquetados que incluem 3H-Dextran e 14C-Inulin após a entrega do cm, e com a quantificação ex vivo da seção co…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e pelo Instituto Nacional de envelhecimento (institutos nacionais de saúde dos EUA; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), o programa de redes de excelência transatlântica Fondation Leducq e o programa de investigação e inovação da UE Horizon 2020 (subvenção n. º 666881; SVDs @ Target). Também gostaríamos de agradecer a Dan Xue pela assistência especializada com ilustrações gráficas.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
Referencias
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