Ontwikkeling van gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populaties in kleine graangewassen door mutageen
Summary
Beschreven is een protocol voor het ontwikkelen van een gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populatie in kleine graangewassen met gebruik van ethyl methanesulfonaat (EMS) als een mutageen. Ook voorzien is een protocol voor mutatie detectie met behulp van de cel-1 test.
Abstract
Gerichte lokale laesies IN Genomes (TILLING) is een krachtige reverse genetics tool die chemische mutagenese en detectie van sequentie variatie in doel genen omvat. TILLING is een zeer waardevol functioneel Genomics-instrument voor genvalidering, vooral in kleine korrels waarin op transformatie gebaseerde benaderingen ernstige beperkingen hebben. Het ontwikkelen van een robuuste, gemutageniseerde populatie is de sleutel tot het bepalen van de efficiëntie van een op TILLING gebaseerd gen-valideringsonderzoek. Een TILLING populatie met een lage totale mutatiefrequentie geeft aan dat een onpraktisch grote populatie moet worden gescreend om gewenste mutaties te vinden, terwijl een hoge mutagene concentratie leidt tot een hoge sterfte in de populatie, wat leidt tot een onvoldoende aantal mutageen personen. Zodra een effectieve populatie is ontwikkeld, zijn er meerdere manieren om mutaties in een gen van belang te detecteren, en de keuze van het platform is afhankelijk van de experimentele schaal en beschikbaarheid van middelen. De cel-1 assay en agarose gel-gebaseerde aanpak voor Mutante identificatie is handig, reproduceerbaar en een minder hulpbronnen intensief platform. Het is voordelig omdat het eenvoudig is, zonder computationele kennis, en het is vooral geschikt voor validatie van een klein aantal genen met basis labapparatuur. In dit artikel worden de methoden beschreven voor de ontwikkeling van een goede TILLING populatie, met inbegrip van de bereiding van de doserings curve, mutagenese en het onderhoud van de Mutante populatie, en screening van de Mutante populatie met behulp van de PCR-gebaseerde cel-1 test .
Introduction
Puntmutaties in genomen kunnen vele nuttige doeleinden voor onderzoekers dienen. Afhankelijk van hun aard en locatie kunnen deze mutaties worden gebruikt om functies toe te wijzen aan genen of zelfs afzonderlijke domeinen van eiwitten die van belang zijn. Aan de andere kant kunnen, als bron van nieuwe genetische variatie, nuttige mutaties worden geselecteerd voor gewenste eigenschappen met behulp van fenotypscreens en verder gebruikt bij gewas verbetering. TILLING is een krachtige reverse genetics tool die chemische mutagenese en detectie van sequentie variatie in het doel gen omvat. Voor het eerst ontwikkeld in Arabidopsis1 es drosophilia melanogaster2, zijn Tilling populaties ontwikkeld en gebruikt in veel kleine graangewassen zoals Braam brood tarwe (Triticum aestivum)3, gerst (Hordeum vulgare)4, tetraploïde durumtarwe(t. dicoccoides durum)5, diploïde tarwe (t. monococcum)6 en de “D” genoom voorlopercellen van tarwe aegilops tauschii7 . Deze middelen zijn gebruikt om de rollen van genen te valideren bij het reguleren van abiotische en biotische stress tolerantie8, het reguleren van bloeitijd9, en het ontwikkelen van nutritioneel superieure gewas rassen5.
Tilling, samen met het gebruik van alkylerende mutagene agentia zoals ethyl methanesulfonaat (EMS), natrium azide, n-methyl-N-nitrosourea (mnu), en methyl methanesulfonaat (MMS), heeft voordelen ten opzichte van andere reverse genetics tools om verschillende redenen. Ten eerste kan mutagenese worden uitgevoerd op nagenoeg elke soort of variëteit van plant10 en is deze onafhankelijk van het knelpunt bij de transformatie, wat in het geval van kleine korrels11bijzonder uitdagend is. Ten tweede kan naast het genereren van Knockout-mutaties die kunnen worden verkregen door andere genvalidatiebenaderingen, een reeks missense en splicing-mutaties worden geïnduceerd, die functies van afzonderlijke domeinen van de eiwitten van belang kunnen onderscheiden12. Bovendien genereert TILLING een onsterfelijke verzameling van mutaties in het genoom; Zo kan een enkele populatie worden gebruikt voor functionele validatie van meerdere genen. Andere tools voor reverse genetica genereren daarentegen alleen middelen die specifiek zijn voor het gen in studie13. Nuttige mutaties geïdentificeerd door middel van BETEGELING kunnen worden ingezet voor fokdoeleinden en zijn niet onderworpen aan regulering, in tegenstelling tot het bewerken van genen, waarvan de niet-transgene classificatie in veel landen nog onzeker is. Dit wordt vooral relevant voor kleine granen die internationaal worden verhandeld14.
TILLING is een eenvoudige en efficiënte genvaliderings strategie en vereist dat mutagenized populaties worden ontwikkeld voor het onderzoeken van genen van belang. Het ontwikkelen van een effectieve gemutageniseerde populatie is de sleutel tot het bepalen van de efficiëntie van een op TILLING gebaseerd gen-valideringsonderzoek. Een TILLING populatie met een lage totale mutatiefrequentie geeft aan dat een onpraktisch grote populatie moet worden gescreend op gewenste mutaties, terwijl een hoge mutagene concentratie leidt tot een hoge sterfte in de populatie en een ontoereikend aantal mutagenized personen. Zodra een goede populatie is ontwikkeld, zijn er meerdere manieren om mutaties in de genen van belang te detecteren, en de keuze van het platform is afhankelijk van de experimentele schaal en beschikbaarheid van middelen. Hele genoom sequentiëren en exoomsequencing sequencing zijn gebruikt om alle mutaties in Tilling populaties in planten met kleine genomen15,16te karakteriseren. Exome sequencing van twee TILLING populaties is uitgevoerd in brood en durumtarwe en is beschikbaar voor het publiek voor het identificeren van gewenste mutaties en het bestellen van mutant lijnen van belang17. Het is een grote openbare bron in termen van beschikbaarheid van wenselijk mutaties; in genvaliderings studies moet de wild-type lijn echter het kandidaatgen bezitten dat van belang is. Helaas is het nog steeds kosten-prohibitief om de exoomsequencing van de hele TILLING populatie te sequenties voor reverse-genetica gebaseerde validering van enkele kandidaatgenen op een andere achtergrond. Amplicon-sequencing en cel-1-gebaseerde assays zijn gebruikt bij het opsporen van mutaties in gerichte populaties in tarwe, en cel-1-assays zijn eenvoudiger, vereisen geen computationele kennis en zijn vooral geschikt voor validatie van een klein aantal genen met basis labomateriaal6,18.
In dit artikel worden beschreven methoden voor de ontwikkeling van een goede TILLING populatie, met inbegrip van de bereiding van de doserings curve, mutagenese en onderhoud van de Mutante populatie, en screening van de Mutante populatie met behulp van de PCR-gebaseerde cel-1 test . Dit protocol is al met succes geïmplementeerd in de ontwikkeling en het gebruik van mutageen populaties van Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, gerst, aegilops tauchii7, en verschillende Anderen. Inbegrepen zijn expliciete details van deze methoden, samen met nuttige tips die onderzoekers helpen bij het ontwikkelen van TILLING-populaties, het gebruik van EMS als een mutagene stof in een kleine graan plant naar keuze.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING is een zeer waardevol reverse genetics tool voor genvalidering, vooral voor kleine granen waar op transformatie gebaseerde benaderingen ernstige knelpunten hebben11. Het ontwikkelen van een mutagene populatie met een hoge mutatiefrequentie is een van de kritische stappen in het uitvoeren van functionele genomics studies. De belangrijkste stap in de ontwikkeling van een robuuste TILLING-populatie is het bepalen van de optimale concentratie van EMS. De overlevings ratio van 40%-60% in de M<s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1016879 en Maryland Agricultural experiment station via MAES Grant No. 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
Referencias
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genética. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genética. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genética. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
