고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

HTPP는 생화학 적 분석과 결합 된 DNA 결합 마이크로 어레이 기술을 사용하여DNA프리마제의 효소 활성에 영향을 미치는 DNA 템플릿의 특정 특징을 통계적으로 식별합니다. 따라서 HTPP는 현장에서 지식의 도약을 촉진하는 기술 플랫폼을 제공합니다. 원시 인식 사이트를 결정하는 데 사용되는 고전적인 도구는 HTPP가 수행하는 반면, 엄청난 양의 데이터를 얻을 수있는 능력이 없습니다.

PBM은 DNA^1,2에대한 전사 인자의 결합 선호도를 결정하기 위해 일상적으로 사용되는 기술이다. 그러나, DNA에 단백질의 약 /과도 결합의 검출에 적합하지 않습니다. 8개의 염기 쌍으로 구성된 모든 가능한 서열에 평균 단백질 결합 특이성에 대한 정보를 제공하는 보편적인 PBM과는 달리, HTPP는 독특한 서열 요소를 포함하는 단일 가닥 DNA 템플릿의 라이브러리를 기반으로 한다. 이러한 DNA 서열 요소는 수만 짧은 (bp의 몇 수) 게놈 서열뿐만 아니라 다른 평균 GC 함량을 가지고 게놈에 존재하는 특정 DNA 반복적 인 서열 요소에 풍부 하게 계산 설계 DNA 서열을 포함 . 이러한 높은 처리량 접근법은 체계적이고 정량적이며 가설 구동적인 방식으로, 프리마제 결합 및 그 효소 활성에 중요한 서열 관련 특성을 결정할 수 있게^{한다 3.} 특히, 프리마제-DNA 결합 선호도(특정 삼중 뉴클레오티드 결합 부위를 측면으로 하는 DNA 서열에 의해 변조)와 프리마제 처리율 사이의 중요한 링크가 이러한 효소 시스템^4에대해 확인되었다.

이 새로운 기술은 광범위하게 연구된 T7 DNA 프리마제에 대해서도 프리마제 인식 부위에 대한 우리의 이해를 재검토하기 위해 적용되었다^5. 구체적으로, 단백질 DNA 결합 마이크로어레이(PBM)를 사용하여 T7 DNA 프리마제(거의 4년 전 ^6년전에 결정된)의 DNA 인식 부위와 같은 고전적인 개념의 재검사는 이러한 인식 사이트의 측면 시퀀스^3. T7 DNA 프리마제(5′-GTC-3′)의 삼중뉴클레오티드 인식 부위를 측면으로 하는 서열이 무작위일 것으로 예상되었다. 대신, 우리는 TG가 풍부한 측면 서열이 처리율의 증가를 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 합성하는 T7 DNA 프리마제의 기회를 증가한다는 것을 것을을 발견했습니다.

시험관 내 단백질의 DNA 결합 특성을 연구하는 데 사용할 수 있는 다른 방법은 전기 영동 이동성 시프트 분석법(EMSA)^7,DNase I 풋프린트^8,표면 플라스몬 공명(SPR)^9,및 남서부 블로팅을 포함합니다. ¹⁰. 그러나, 이들은 적은 수의 DNA 서열을 조사하는 데에만 적용 가능한 저처리법입니다. 또한, 이러한 기술 들(예를 들어, EMSA)의 정밀도 및 감도는 낮다. 한편, 시험관내^{선택(11)은} PBM과 유사하게, 수많은 결합 서열의 식별을 위해 사용될 수 있는 기술이다. 그러나, 낮은 친화도 서열은 일반적으로 시험관 내 선택의 대부분의 응용 프로그램에서 제외; 따라서 이 방법은 사용 가능한 모든 시퀀스에 대한 비교 바인딩 데이터를 가져오는 데 적합하지 않습니다. 범용 PBM^1,2는 주로 원핵생물 및 진핵생물로부터의 전사 인자의 결합 특이성뿐만 아니라 특정 인자(예를 들어, 특정 리간드, 보조 인자 등)의 결합 특이성을 특성화하는 데 사용됩니다. 이 상호 작용에 영향을^{미치는 12}.

HTPP는 전례없는 높은 처리량의 통계적 파워와 높은 정밀도를 결합하여 결합 서열 컨텍스트에 대한 정보를 제공함으로써 PBM 응용 프로그램을 DNA 처리 효소로 확장합니다. 이러한 데이터는 다른 사용 가능한 기술의 전술한 기술적 한계로 인해 프리마제 및 관련 효소(DNA에 약/과도 결합)에 대해 아직 획득되지 않았습니다.