Vi visar en metod för nekropsy och dissektion av mus prostatacancer modeller, med fokus på prostata tumör dissektion. Ett steg-för-steg-protokoll för generering av mus prostata tumör organoider presenteras också.
Metoder baserade på homolog rekombination för att modifiera gener har avsevärt främat biologisk forskning. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är en rigorös metod för att studera utveckling och sjukdom hos däggdjur. Vårt laboratorium har utvecklat flera GEMMs av prostatacancer (PCa) som saknar uttryck för en eller flera tumör suppressor gener med hjälp av platsspecifika CRE-loxP driver system och en prostata-specifik promotor. I denna artikel, vi beskriver vår metod för obduktion av dessa PCa gemms, främst inriktad på dissektion av mus prostatatumörer. Nya metoder som utvecklats under det senaste decenniet har underlättat kulturen i epitelial-härledda celler för att modellera organsystem in vitro i tre dimensioner. Vi detalj också en 3D-cellkultur metod för att generera tumör organoider från mus PCa GEMMs. Preklinisk cancerforskning har dominerats av 2D-cellkultur och cellinsderived eller patient-härledda xenograft-modeller. Dessa metoder saknar tumör mikromiljö, en begränsning av att använda dessa tekniker i prekliniska studier. GEMMs är mer fysiologiskt-relevant för att förstå tumorigenes och cancer progression. Tumör Organoid kultur är en in vitro-modellsystem som recapitulates tumör arkitektur och cell härstamning egenskaper. Dessutom, 3D-cellkultur metoder möjliggör tillväxt av normala celler för jämförelse med tumör cellkulturer, sällan möjligt med hjälp av 2D cellkultur tekniker. I kombination, användning av GEMMs och 3D-cellkultur i prekliniska studier har potential att förbättra vår förståelse av cancerbiologi.
Sedan slutet av 1980-talet har förmågan att förändra gener genom homolog rekombination kraftigt Avancerat studiet av biologiska system1. Inducerbara, vävnads-eller cellspecifika promotor system och platsspecifika rekombinaser, såsom CRE-loxP, har avancerade genetiska studier genom att underlätta kontrollen över genetiska modifikationer både temporally och rumsligt2,3, 4. Kombinationen av dessa genetiska strategier har skapat ett brett spektrum av experimentella modellsystem5,6,7.
Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är ett integrerat verktyg för att bedöma hur enskilda gener eller grupper av gener påverkar utvecklingen av däggdjur och sjukdomar. I preklinisk cancerforskning, GEMMs är den mest fysiologiskt relevanta och rigorösa metod för att studera cancerutveckling, progression, och behandling8. Vårt laboratorium är specialiserat på att generera och karakterisera cancer GEMMs.
Den mest högt diagnostiserade icke-kutana cancer bland män i USA är prostatacancer (PCa). Majoriteten av patienter med PCa har låg risk sjukdom och hög sannolikhet för överlevnad, men överlevnaden sjunker drastiskt när sjukdomen diagnostiseras i framskridet stadium eller om riktad hormonell terapi inducerar progression till aggressiva, icke-botas PCa undertyper9,10. Vårt laboratorium har utvecklat gemms som utnyttjar floxed alleler av en eller flera tumör suppressor gener. Rekombination och förlust av tumör suppressor genuttryck förekommer specifikt i prostatan eftersom vi har infört en transgenens med CRE driver nedströms av probasin promotorn aktiveras endast i prostata epitelceller11, 12. vi har också fött upp våra gemms att innehålla en CRE reporter transgenens kallas MT/mg, som inducerar tomat fluorescerande proteinuttryck i celler som saknar CRE och grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i celler med CRE13. Medan presentationen av denna metod och våra representativa resultat visar GEMMs vi studerar i vårt laboratorium, kan detta protokoll användas för att generera prostatacancer organoider från någon musmodell. Men, som diskuteras i detalj i vår representativa resultat avsnitt, vi har observerat att vissa tumör egenskaper är optimala för prostatacancer Organoid generation.
Under det senaste decenniet, nya metoder för odling av celler från vävnader av epitelial ursprung har lett till betydande framsteg i vår förmåga att modellera organsystem in vitro-14,15. Termen “3D cellkultur” har tillskrivits de tekniker som är involverade i att etablera och underhålla organoider, som i allmänhet kan definieras som strukturer som består av celler som monterar sekundärarkitektur som drivs av organspecifika cell härstamning egenskaper16. Dessa nya metoder skiljer sig från klassisk 2D-cellkultur i att celler inte kräver omvandling eller i för långsiktig tillväxt; Sålunda, 3D-kulturer av normala celler kan jämföras med sjuka celler. Detta är särskilt värdefullt i cancerforskning där normala cell kontrollkulturer har vanligtvis inte varit tillgängliga. Dessutom bildar organoider spontant sekundära vävnads arkitekturer med lämpligt differentierade celltyper, vilket gör dem till ett bättre modellsystem för att förstå cancer in vitro än 2D-celllinjer17. Vårt laboratorium har skapat 3D Organoid linjer från tumör frågan isolerad från våra PCa GEMMs att komplettera våra in vivo data och utföra experiment som inte skulle vara möjligt i GEMMs.
I den här artikeln presenterar vi skriftliga och visuella protokoll för fullständig nekropsy av PCa GEMMs, inklusive dissektion av distinkta mus prostata lober och metastatiska lesioner. Vi beskriver och visar en steg-för-steg-metod för att generera organoider från mus prostatatumörer baserat på ett protokoll som tidigare publicerats av Drost et al. för att härleda organoider från normal mus prostata epitelial vävnad18.
Kritiska steg inom protokollet för prostata tumör dissektion och Organoid generation
Avlägsnande av icke-prostatavävnad och fin dissektion av musen prostata tumör är avgörande för den optimala generationen av cancer organoider eftersom både icke-prostata epitelceller och normal prostata epitelceller kommer att generera organoider. För solida prostatatumörer specifikt, det är viktigt att isolera områden av livskraftiga tumör för att avlägsna kontaminering med nekrotisk vävnad som skull…
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka Calvin Kuo Laboratory vid Stanford University för att ge HEK293 celler stabilt transfekterade med antingen ha-Mouse noggin-FC eller ha-Mouse Rspo1-FC. Vi skulle också vilja tacka Dr Dean Tang för att ge oss tillgång till fluorescerande dissektion Mikroskop i hans laboratorium. Detta arbete stöddes av CA179907 till D.W.G. från National Cancer Institute. Delade resurser på Roswell Park omfattande Cancer Center stöddes av National Institutes of Health Cancer Center support Grant CA016056.
0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |