Generation af tumor Organoider fra genetisk manipulerede musemodeller af prostata cancer

Siden slutningen af 1980 ‘ erne, evnen til at ændre gener ved homologe rekombination har i høj grad fremskreden studiet af biologiske systemer¹. Inducerbare, vævs-eller celle specifikke promotor-systemer og site-specifikke rekombinaser, såsom CRE-loxp, har avancerede genetiske undersøgelser ved at lette kontrollen med genetiske modifikationer både timeligt og rumligt^{2,3, 4}. Kombinationen af disse genetiske strategier har skabt en bred vifte af eksperimentelle modelsystemer^5,6,7.

Genetisk modificerede musemodeller (Gemm’er) er et integreret redskab til at vurdere, hvordan individuelle gener eller grupper af gener påvirker pattedyrs udvikling og sygdom. I præ-klinisk kræftforskning, GEMMs er den mest fysiologisk-relevant og stringent metode til at studere kræft udvikling, progression, og behandling⁸. Vores laboratorium har specialiseret sig i at generere og karakterisere kræft GEMMs.

Den mest højt diagnosticerede ikke-kutane kræft blandt mænd i USA er prostatacancer (PCa). Størstedelen af patienterne med PCa har lav-risiko sygdom og høj sandsynlighed for overlevelse, men overlevelsesraten falder drastisk, når sygdommen diagnosticeres på avancerede stadier, eller hvis målrettet hormonel terapi inducerer progression til aggressive, ikke-helbredelig PCa undertyper^9,10. Vores laboratorium har udviklet gemmer, der udnytter floxed alleler af en eller flere tumor suppressor gener. Rekombination og tab af tumor suppressor genekspression forekommer specifikt i prostata, fordi vi har introduceret et Trans gen med CRE rekombinase nedstrøms for probasin promotoren aktiveret kun i prostata epiteliale celler^{11, 12}. vi har også opdrættet vores gemmer til at indeholde en CRE reporter transgen kaldet MT/mG, som inducerer tomat fluorescerende protein udtryk i celler, der mangler CRE og grønt fluorescerende protein (gfp) udtryk i celler med CRE¹³. Mens præsentationen af denne metode og vores repræsentative resultater viser GEMMs vi studere i vores laboratorium, denne protokol kan bruges til at generere prostatacancer organoider fra enhver musemodel. Men, som diskuteret i detaljer i vores repræsentative resultater sektion, vi har observeret, at visse tumorkarakteristika er optimale for prostatacancer organoid generation.

I det sidste årti har nye metoder til dyrkning af celler fra væv af epitelial oprindelse ført til betydelige fremskridt i vores evne til at modellere orgel systemer in vitro^14,15. Udtrykket “3D-cellekultur” er blevet tilskrevet de teknikker, der er involveret i etablering og vedligeholdelse af organoider, som generelt kan defineres som strukturer, der består af celler, som samler sekundær arkitektur drevet af organspecifik cellelinje Karakteristik¹⁶. Disse nye metoder adskiller sig fra klassisk 2D-cellekultur i, at cellerne ikke kræver transformation eller immortalization for langsigtet vækst; således kan 3D-kulturer af normale celler sammenlignes med syge celler. Dette er især værdifuldt i kræftforskning, hvor normale celle kontrol kulturer har typisk ikke været tilgængelige. Desuden danner organoider spontant sekundære vævs arkitekturer med passende differentierede celletyper, hvilket gør dem til et bedre model system til at forstå kræft in vitro end 2D cellelinjer¹⁷. Vores laboratorium har skabt 3D organoid linjer fra tumor problem isoleret fra vores PCa GEMMs at supplere vores in vivo data og udføre eksperimenter, som ikke ville være muligt i GEMMs.

I denne artikel præsenterer vi skriftlige og visuelle protokoller for den komplette nekropsy af PCa GEMMs, herunder dissektion af forskellige mus prostata lapper og metastatiske læsioner. Vi beskriver og viser en trin-for-trin metode til generering af organoider fra mus prostata tumorer baseret på en protokol, der tidligere blev offentliggjort af Drost et al. for at udlede organoider fra normal mus prostata epitelial væv¹⁸.