Разделение эпидермиса и дермы крыс термолизином для обнаружения сайт-специфической воспалительной мРНК и белка
Summary
Здесь представлен протокол отделения эпидермиса от дермы для оценки выработки медиатора воспалительного средства. После воспаления эпидермис задней лапы крыс отделяется от дермы термолизином при 4 °C. Затем эпидермис используется для анализа мРНК методом ОТ-ПЦР и оценки белка с помощью вестерн-блотт и иммуногистохимии.
Abstract
Простые в использовании и недорогие методы необходимы для определения специфического для участка производства воспалительных медиаторов и нейротрофиных препаратов во время повреждения кожи, воспаления и / или сенсибилизации. Целью этого исследования является описание протокола разделения эпидермиса и дермы с использованием термолизина, протеиназы, которая активна при 4 ° C. Чтобы проиллюстрировать эту процедуру, крыс Sprague Dawley анестезируют, а правым задним лапам вводят каррагинан. Через шесть и двенадцать часов после инъекции крыс с воспалением и наивных крыс усыпляют, а кусок задней лапы, гламурной кожи помещают в холодную модифицированную орлиную среду Дульбекко. Затем эпидермис отделяется на базальной мембране от дермы термолизином в PBS с хлоридом кальция. Далее дерму закрепляется микродиссекционными щипцами, а эпидермис аккуратно дразнят. Толуидиновым синим окрашиванием участков тканей показывают, что эпидермис отделяется чисто от дермы у базальной мембраны. Все клеточные слои кератиноцитов остаются нетронутыми, а эпидермальные гребни рете вместе с вмятинами от кожных сосочков отчетливо наблюдаются. Качественная и в режиме реального времени ОТ-ПЦР используется для определения фактора роста нервов и уровней экспрессии интерлейкина-6. Вестерн-блоттинг и иммуногистохимия, наконец, выполняются для обнаружения количества фактора роста нервов. Этот отчет иллюстрирует, что переваривание холодного термолизина является эффективным методом отделения эпидермиса от дермы для оценки изменений мРНК и белка во время воспаления.
Introduction
Оценка медиаторов воспаления и нейротрофических факторов со стороны кожи может быть ограничена из-за неоднородности типов клеток, обнаруженных в воспаленной дерме и эпидермисе1,2,3. Недавно было рассмотрено несколько ферментов, химических, термических или механических методов, включающих разделение двух слоев или для выполнения диссоциации клеток для оценки4. Кислота, щелочь, нейтральная соль и тепло могут быстро отделить эпидермис от дермы, но клеточный и внеклеточный отек часто возникает5,6. Трипсин, панкреатин, эластаза, кератиназа, коллагеназа, проназа, диспаза и термолизин являются ферментами, которые использовались для эпидермально-дермального разделения4,7. Трипсин и другие широкомасштабные протеолитические ферменты активны при 37-40 °C, но должны тщательно контролироваться, чтобы предотвратить диссоциацию эпидермальных слоев. Рассеивание расщепляет эпидермис на пластинке денса, но требует 24 ч для отделения в холодных4,8 или более коротких временных точках при 37 °C4,9. Ограничивающей особенностью всех этих методик является потенциальное нарушение морфологии тканей и потеря целостности мРНК и белка.
Для поддержания целостности мРНК и белка метод отделения кожи следует проводить на холоде в течение короткого периода времени. При оценке методов разделения кожи для исследований воспаления термолизин является эффективным ферментом для отделения эпидермиса от дермы при низких температурах4. Термолизин активен при 4 °C, расщепляет эпидермальные гемидемосомы от lamina lucida и отделяет эпидермис от дермы в течение 1–3 ч4,8,10. Целью данного отчета является оптимизация использования термолизина для отделения воспаленного эпидермиса крыс от дермы для выявления уровней мРНК и белка для медиаторов воспаления и нейротрофических факторов. Было представлено несколько предварительных докладов11,12,13,14,15. Целью данной рукописи является описание оптимальной методики разделения кожи с использованием термолизина и демонстрация обнаружения 1) маркеров воспаления, 2) мРНК интерлейкина-6 (IL-6) и 3) мРНК и белка фактора роста нервов (NGF) в эпидермисе крыс с каррагинаном-индуцированным воспалением (C-II)16,17. Предварительный отчет с использованием полной адъювантной модели Фройнда показывает, что уровни мРНК и белка NGF увеличиваются на ранней стадии во время воспаления15. У мышей сенсибилизация кожи при местном применении оксазолона вызывает ранний подъем мРНК IL-6 с использованием гибридизации in situ36. Как IL-6, так и NGF были замешаны в C-II18,19,но не было сообщений, описывающих уровни мРНК или белка для IL-6 или NGF конкретно из эпидермиса во время острых стадий C-II.
Техника термолизина недорогая и простая в исполнении. Кроме того, отделение термолизинов эпидермиса от дермы позволяет проводить мРНК, вестерн-блот и иммуногистохимический анализ медиаторов воспаления и нейротрофических факторов в процессе воспаления15. Исследователи должны быть в состоянии легко использовать эту технику как в доклинических, так и в клинических исследованиях воспаления кожи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование определило, что эпидермис глазчатой кожи задней лапы крысы легко отделялся от дермы с помощью термолизина (0,5 мГ/мл) в PBS с 1 мМ хлорида кальция при 4 °C в течение 2,5 ч. Гистологическая оценка показала, что эпидермис был отделен от дермы на базальной мембране и что эпидермальные…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этого исследования было предоставлено Национальными институтами здравоохранения NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
Referencias
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
