Separazione dell'epidermide e del derma di ratto con termolisina per rilevare mRNA e proteine infiammatorie sito-specifiche
Summary
Qui è presentato un protocollo per la separazione dell’epidermide dal derma per valutare la produzione di mediatori infiammatori. A seguito dell’infiammazione, l’epidermide della zampa posteriore di ratto viene separata dal derma mediante termolisina a 4 °C. L’epidermide viene quindi utilizzata per l’analisi dell’mRNA mediante RT-PCR e la valutazione delle proteine mediante western blot e immunoistochimica.
Abstract
Sono necessarie tecniche facili da usare e poco costose per determinare la produzione sito-specifica di mediatori infiammatori e neurotrofine durante lesioni cutanee, infiammazione e / o sensibilizzazione. L’obiettivo di questo studio è quello di descrivere un protocollo di separazione epidermico-dermica utilizzando la termolisina, una proteinasi attiva a 4 °C. Per illustrare questa procedura, i ratti Sprague Dawley vengono anestetizzati e le zampe posteriori destre vengono iniettate con carragenina. Sei e dodici ore dopo l’iniezione, i ratti con infiammazione e ratti ingenui vengono eutanasizzati e un pezzo di zampa posteriore, la pelle glabra viene posto nel freddo Dulbecco’s Modified Eagle Medium. L’epidermide viene quindi separata dalla membrana basale dal derma dalla termolisina in PBS con cloruro di calcio. Successivamente, il derma è protetto da una pinca di microdissezione e l’epidermide viene delicatamente presa in giro. La colorazione blu toluidina delle sezioni tissutali mostra che l’epidermide è separata in modo pulito dal derma nella membrana basale. Tutti gli strati cellulari di cheratinociti rimangono intatti e le creste della rete epidermica insieme alle rientranze delle papille dermiche sono chiaramente osservate. La RT-PCR qualitativa e in tempo reale viene utilizzata per determinare il fattore di crescita nervoso e i livelli di espressione dell’interleuchina-6. Western blotting e immunoistochimica vengono infine eseguiti per rilevare quantità di fattore di crescita nervoso. Questo rapporto illustra che la digestione della termolisina fredda è un metodo efficace per separare l’epidermide dal derma per la valutazione dell’mRNA e delle alterazioni proteiche durante l’infiammazione.
Introduction
La valutazione dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici dalla pelle può essere limitata a causa dell’eterogeneità dei tipi di cellule presenti nel derma infiammato e nell’epidermide1,2,3. Diversi enzimi, tecniche chimiche, termiche o meccaniche che comportano la separazione dei due strati o per eseguire la dissociazione cellulare per la valutazione sono stati recentemente esaminati4. Acido, alcali, sale neutro e calore possono dividere rapidamente l’epidermide dal derma, ma il gonfiore cellulare ed extracellulare si verifica spesso5,6. Tripsina, pancreatina, elastasi, cheratinasi, collagenasi, pronasi, dispasi e termolisina sono enzimi che sono stati utilizzati per la separazione epidermico-dermica4,7. La tripsina e altri enzimi proteolitici su larga scala sono attivi a 37-40 °C, ma devono essere monitorati attentamente per prevenire la dissociazione degli strati epidermici. La dispasi fende l’epidermide alla lamina densa, ma richiede 24 ore per la separazione nel freddo4,8 o punti temporali più brevi a 37 °C4,9. Una caratteristica limitante di tutte queste tecniche è la potenziale interruzione della morfologia dei tessuti e la perdita di integrità di mRNA e proteine.
Per mantenere l’integrità dell’mRNA e delle proteine, è necessario eseguire un metodo di separazione cutanea al freddo per un breve periodo di tempo. Nella valutazione delle tecniche di separazione cutanea per gli studi sull’infiammazione, la termolisina è un enzima efficace per separare l’epidermide dal derma a basse temperature4. La termolisi è attiva a 4 °C, scinde gli emidesmosomi epidermici dalla lamina lucida e separa l’epidermide dal derma entro 1-3 h4,8,10. L’obiettivo di questo rapporto è ottimizzare l’uso della termolisina per la separazione dell’epidermide di ratto infiammata dal derma per rilevare i livelli di mRNA e proteine per mediatori infiammatori e fattori neurotrofici. Sono state presentate diverse relazioni preliminari11,12,13,14,15. L’obiettivo di questo manoscritto è descrivere una tecnica ottimale di separazione cutanea utilizzando la termolisina e dimostrare il rilevamento di 1) marcatori di infiammazione, 2) interleuchina-6 (IL-6) mRNA e 3) mRNA e proteine del fattore di crescita nervoso (NGF) nell’epidermide di ratti con infiammazione indotta da carragenina (C-II)16,17. Un rapporto preliminare che utilizza il modello adiuvante completo di Freund indica che i livelli di mRNA e proteine NGF aumentano precocemente durante l’infiammazione15. Nei topi, la sensibilizzazione cutanea con l’applicazione topica di oxazolone provoca un aumento precoce dell’mRNA IL-6 utilizzando l’ibridazione in situ36. Sia IL-6 che NGF sono stati implicati in C-II18,19, ma non ci sono state segnalazioni che descrivono livelli di mRNA o proteine per IL-6 o NGF specificamente dall’epidermide durante le fasi acute di C-II.
La tecnica della termolisina è economica e semplice da eseguire. Inoltre, la separazione termolitica dell’epidermide dal derma consente l’mRNA, il western blot e l’analisi immunoistochimica dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici durante il processo di infiammazione15. I ricercatori dovrebbero essere in grado di utilizzare facilmente questa tecnica in studi preclinici e clinici sull’infiammazione della pelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio ha determinato che l’epidermide della pelle glabra della zampa posteriore di ratto era facilmente separata dal derma usando termolisina (0,5 mG / mL) in PBS con 1 mM di cloruro di calcio a 4 ° C per 2,5 ore. La valutazione istologica ha indicato che l’epidermide era separata dal derma della membrana basale e che le creste della rete epidermica erano intatte. La termolisina è una metalloendopeptidasi extracellulare prodotta da Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus2…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito dal National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
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