本研究では、ヒトの神経オルガノイド内のヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫の発達を研究するための関連的かつ正確なモデルとして、2つの特定のヒト神経オルガノイドを導出するプロトコルを紹介し、説明する。三次元オルガノイドを生成する分化。
インビトロニューラルモデルの欠如は、神経病理学の医学的進歩に重要な障害である。関連する細胞モデルの確立は、これらの疾患の病理学的メカニズムをよりよく理解し、新しい治療目標と戦略を同定するために重要である。適切にするためには、インビトロモデルは、ヒト疾患の病理学的特徴を再現する必要があります。しかし、神経変性疾患の文脈において、関連するインビトロモデルは、貴重な治療機会として神経細胞置換を提供すべきである。
このようなモデルは、治療分子のスクリーニングを可能にするだけでなく、神経プロトコルの分化を最適化するためにも使用することができます[例えば、パーキンソン病(PD)の移植のコンテキストで]。本研究では、ヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫発達(NO)と2)ニューロンドーパミン作動性(DA)分化の2つのインビトロプロトコルを用いて、3次元(3D)オルガノイドを生成する。この目的のために、ヒト胚性幹細胞(hESC)分化に由来するサイズ校正された神経球の産生を可能にする、十分に標準化されたプロトコルが確立された。最初のモデルは、神経オルガノイド内の神経膠芽腫の発達中に起こる分子および細胞事象を明らかにするために使用することができ、DAオルガノイドはパーキンソン病の細胞治療に適したDAニューロンの適切な供給源を表すだけでなく、薬物検査に使用される。
世界保健機関(WHO)は、アストロサイトーマを低等級(II等級)または高等級(グレードIIIおよびIV)に分類します。多形性膠芽腫(GBM)は、天体細胞腫グレードIVであり、原発性脳腫瘍の中で最も致死的であり、現在の治療形態の全ての形態に耐性である1。神経外科、化学療法、放射線療法を含む標準的なケア療法にもかかわらず、GBMは致命的なままであり、15ヶ月の全体的な生存率は過去15年間で劇的に変化していません2。GBM病因の理解を大きく進歩させるためには、関連するモデルの使用が重要です。これまでのところ、GBMの研究は、細胞株、げっ歯類の組織色異性スライス、および患者由来細胞のマウスまたはトランスジェニックマウスへの異種移植に依存しており、自発的腫瘍3,4を発症する。これらのモデルは、脳転移や腫瘍の攻撃性を研究するのに有用であったが、それらは種間の違いによって制限され、結果として生じる結論は誤ってヒト組織に翻訳される可能性がある。さらに、ヒト細胞を有する既存のモデルは、宿主組織/腫瘍相互作用3、4の不在によっても制限される。実験モデルは、基礎科学から治療目標への翻訳に不可欠です。したがって、GBMイニシニング細胞(GIC)と共培養したインビトロヒト神経オルガノイドを産生するプロトコルを記述することは、GBM開発の形態学的および機能的特徴を模倣する関連システムを提供することができる。このシステムは、侵入細胞や壊死領域の拡散移行など、GBM開発の生体内特徴の一部を再現し、腫瘍生物学に関連する遺伝子発現を強調する。以前に明らかにされたように、いくつかの重要なマイクロRNAは、3D神経組織5、6内のGIC開発中に誘導される。
PDは主要な神経変性疾患であり、複数の神経サブタイプ7の変性に関連する。症状の進行性の発症(例えば、ブラジキネシア、非対称休息振戦、剛性および姿勢不安定)が疾患を特徴付けても、その正確な病因は明確に確立されていない。実際、多くの研究は、主要な危険因子が遺伝的要因と環境要因の組み合わせから生じ得る証拠を強調しています。パーキンソン病の症状は、サブスタンシアニグラ(SN)におけるドーパミン作動性ニューロンの両側変性に関連し、線条体8、9に突出するドーパミン作動性(DA)軸の消失につながる。したがって、線条体ドーパミンレベルの低下は、PD患者における運動機能障害の進行と相関する。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)を含み、アミノ酸L-チロシンをL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-DOPA、ドーパミン前駆体)に変換するカテコールラミン作動性神経伝達物質の合成における重要な酵素である。TH活性の早期喪失に続いてTHタンパク質発現の低下は、PDの特徴である。
本研究では、ヒト神経オルガノイドを用いた2つのプロトコルについて説明し、1つはTH陽性細胞を含む中脳様表現型に特異的に向いている。
このプロトコルの最も重要な側面の1つは、細胞培養中のhESC多能性の維持と球および神経オルガノイド形態の密接なモニタリングを含む。hESCは非常に敏感であり、すべての操作は、細胞死と同様、早期制御されていない分化につながる可能性があります。実験の再現性を高め、異常な核型事象の発生を避けるために、染色体安定性の検証後、最も低い通路でHESCのいくつかのバッチを凍結保存することをお勧めします。また、実験ごとに新しいバイアルを解凍し、毎日細胞の挙動を確認することをお勧めします。球が異常に大きいサイズで屈折が少ない場合、それらは凝集し始め、死に始める可能性が高い。
このシステムの1つの改善は、灌流または血管化システムの実装(内皮細胞を追加することによって、または3D流体マイクロチップ内)12、13である。しかし、神経オルガノイド(≤300 μm)の厚さを制御することで、酸素や栄養の効率的な受動的な灌流を可能にし、壊死を防ぎます。もう一つの改善は、免疫細胞(ミクログリア)の導入である。これらの制限を念頭に置いて、神経オルガノイドとGICシステムは、いくつかの理由で関連するツールでありうる。まず、このシステムは、治療化合物がオルガノイドまたは腫瘍細胞にどのように影響するかを監視する薬物スクリーニングを可能にする。第二に、細胞間相互作用を研究することができ、個人および集団の侵略の根底にある微小環境決定要因を可視化し、5、6、13を探索することができる。
パーキンソン病の文脈では、DAニューロンに濃縮された神経オルガノイドは、疾患の発症を研究するために関連する正確な3Dモデルを表すことができます。以前の研究では、DAニューロンに向かって分化したパーキンソン病患者由来の多能性幹細胞が、影響を受けるニューロンサブタイプの研究に使用されている。なお、α-シヌクレインの蓄積や酸化ストレスに対する感受性などの疾患関連表現型が14,15に観察されている。また、神経オルガノイドは、治療分子をスクリーニングするツールとして用いてもよい。しかし, ドーパミン産生や電気生理学的活性などの DA ニューロンの生存と機能性を評価するために、特定の関連する読み出しを設定する必要があります。.全体として、このプロトコルは、神経オルガノイドを生成するために2つの標準化された正確な幹細胞ベースのアプローチを提供します。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、ラ・リーグ・ジェネボワス・コントル・ル・ガン(ジュネーブ、スイス)、ISREC財団(ローザンヌ、スイス)、クレイトン研究財団(米国ヒューストン、テキサス州)に対する財政支援に感謝しています。さらに、著者はHES-HOとワイスセンターの財政支援に感謝しています。クラウスの研究室で有益なディスカッションとサポートを提供してくださったことに感謝し、ハラ・クタッシュ博士の校正に感謝します。
6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |