EVOLVER を用いた自動、高スループット、連続細胞増殖実験の設計

1. 培地、バイアル、接種の準備 注:このプロトコルは、ユーザがすでに eVOLVER システムを較正しており、前の作業16で説明したスマートスリーブ構成を使用していることを前提としています。スマートスリーブは簡単に再設計または変更されますが、音量および制御パラメータの設定詳細は、代替構成によって異なる場合があります。 実験の前日に、少なくとも300に設定された振盪インキュベーター中で30° c の YPD 培地 (酵母ペプトンデキストロース) にセレビシエ BY4741 の参照菌株および変異株の 2 mL の一晩液体培養液を調製する。 無菌 YPD メディアを、チューブを取り付けたオートクレーブに入れた清潔なボトルに移します。あるいは、媒体は管と事前に取り付けられたボトルに直接オートクレーブすることができる。注:ボトルは、キャップに穴をあけ、それをコネクタで貫通して所定の位置に固定することでチューブにフィットします。資料の表を参照してください。 各バイアルに攪拌バーを追加し、流入および流出ストローを備えたバイアル蓋にネジ。すべてのコンポーネントが目視検査によってクリーンであることを確認します。 オートクレーブ可能ラックにバイアルを配置し、箔で覆い、20分の滅菌ステップで重力または真空サイクルでオートクレーブします。 2. 実験の設定 3つの大きなビーカーに、10% の漂白剤の 500 mL、10% の漂白剤の 200 mL、および 70% のエタノールの 300 mL を準備します。 EVOLVER デバイスのスイッチを使用して、eVOLVER の5v 電源をオンにし、5秒間待ってから、12v 電源をオンにします。 同じメディア・ボトルから複数のバイアルを実行している場合は、複数のメディア入力ラインをチューブ・スプリッタで接続します。カスタムチューブスプリッタはルアーコンポーネントで構築することができます。 最初の漂白ビーカーにメディア入力ラインを沈め、第2の漂白ビーカーにメディア流出ラインを浸す。メディア入力ラインの下流側の端を、流出ラインとともに2番目のビーカーに配置します。廃棄物明細行を廃棄 carboy に配置します。 1-2 L の漂白剤を carboy に添加し、実験中に発生した廃棄物を滅菌します。廃棄物を適切に処理するために、安全コーディネーターに相談すること。 EVOLVER 上のタッチスクリーンを使用して、セットアップセクションに移動し、10% の漂白剤で流体ラインを埋めるために 20 s のためのすべてのポンプを実行します。走行中は、すべてのラインが充填されており、ポンプが正常に動作していることを目視検査で確認してください。漂白剤は、滅菌するために少なくとも30分のラインに座ることができます。 ラインが水没しなくなるまでタッチスクリーンアプリを使用してポンプを再度実行し、線を通して空気を押して、できるだけ多くの漂白剤を取り出します。 メディア入力ラインをエタノールビーカーに入れ、上記のように繰り返し、エタノールで線を充填し、空気で洗い流す。注:エタノールが早く死滅するので、滅菌のために30分待つ必要はありません。 ルアー・コネクター付きのメディア・ボトルにメディア入力ラインを取り付け、媒体が完全にラインを通過するまでポンプを作動させることにより、残留エタノールをフラッシュします。 部分的に eVOLVER スマートスリーブに滅菌バイアルを挿入し、ライン上のカラーコーディングに応じて、適切な位置にラインをフック。まず、短い流入わらに入力ラインを取り付け、その後、長い排水わらにラインを無駄にします。注意:接続が緩いか、回線が正しく配線されていないかを確認することが重要です。これを怠ると、オーバーフローが発生し、スマートスリーブに損傷を与える可能性があります。 すべてのポンプを10秒単位で実行して、バイアルにメディアを充填します。目視検査の流出ポンプによって確実に流出のわらによって媒体を取除くことは効果的にオーバーフローを防ぐためにである。流出のわらが効率的に機能していないように見える場合は、流体線の接続と蠕動ポンプを検査します。必要に応じて部品を修正または交換します。 スマートスリーブに完全に包まれるまでバイアルを押し下げます。 インタラクティブセットアップページの eVOLVER タッチスクリーンを使用して、実験パラメータの初期条件を設定します。すべてのバイアルについて、温度を30° c に設定し、攪拌して10にします。これは、タッチスクリーン上で指をドラッグしてすべてのバイアルを選択することによって、一度にすべてのバイアルに対して行うことができます。 3. eVOLVER ソフトウェアの設定とアルゴリズム培養ルーチンのプログラミング コンピュータの eVOLVER ダッシュボードで、[テストマネージャ] ページに移動します。実験ナビゲータパネルで基本実験を選択するか、既存の実験を開始点として選び、[新規作成] をクリックします。注:実験定義が実験マネージャに保存されているレポに GitHub リンクを貼り付けることによって、他のグループからの実験を使用することが可能です。 実験を実行する実験名と eVOLVER デバイスを指定します。ページ上でこれらのフィールドを変更して、必要なキャリブレーション設定が選択されていることを確認してください。 バイアルセレクターとパラメータ定義ペインを使用して、実験条件を設定します。たとえば、バイアル0-4 の温度を30° c に設定するには、バイアルセレクターでバイアルを選択し、パラメーター定義を30に設定し、「 set」をクリックします。各バイアルの上限と下限のしきい値を設定するには、OD のこれを繰り返します。 実験パラメータの定義が完了したら、[保存] をクリックして実験を保存し、[開始] をクリックして実行します。 4. リアルタイムでの実験とモニタリングの開始 実験が進行したら、対話型ダッシュボードのリアルタイムデータパネルに移動します。各バイアルについて、OD 値がゼロで保持されていること、およびその温度がグラフを参照することによってプログラムレベルに向かって進んでいることを確認します。 接種を調製するために、一晩培養物の OD を測定し、25 mL のバイアル容積を仮定して所望の倍希釈量を計算し、そしてサンプリングポートを通して試料をバイアル中にピペットの量を算出する。例えば、約0.05 の所望の開始 OD に到達するために、培養液は、OD 2.0 である一晩培養物から、625μ l の細胞を各バイアルに添加すべきである。 それに応じて OD グラフが更新されていることを確認するために、ダッシュボード上のグラフを確認してください。所望の開始 OD の近くへの増加は、グラフに見られるべきです. ダッシュボードの対応するグラフを参照して、実験全体でさまざまなデータタイプ (OD、温度、成長率、世代、メディア消費など) を追跡します。これらの値は、ユーザによる実験的な決定 (例えばスケジュール timepoints) を通知したり、自動フィードバックを実行する関数で使用されることさえあります。 メディアボトルの mid 実験を置き換えるには、[実験マネージャ] パネルで実験を一時停止して、ポンプイベントが発生しないようにします。すぐに空のボトルからメディアラインを緩め、新しいボトルに接続します。汚染を防ぐためにチューブの先端に触れないようにしてください。実験マネージャで実験を再開します。 5. eVOLVER バイアルから酵母細胞をサンプリング シクロヘキサミド溶液を調製してタンパク質合成を阻害し、酵母細胞をフローサイトメトリー分析用に修正します。15 mL の円錐形の管で、PBS の 12 mL および 20 mg/mL のシクロヘキサミドと 5 s の渦の12μ l を加えてください。 マルチチャンネルピペットを使用して、アリコート100μ l を 96-ウェル丸底プレートの各ウェルに注入します。 アルミホイルでプレートを巻いて光を遮断し、必要になるまで4° c で保管してください。 サンプルには、延長長さ200μ l の先端を使用してバイアル蓋のサンプリングポートを介してピペット。 バイアルの100μ l を固定プレートのウェルに入れ、ピペットで上下にピペッティングして 2 ~ 3 を混合し、次にホイルで回収し、プレートを4° c に戻します。 6. 実験ブレークダウンとクリーンアップ 大きなビーカーに 10% の漂白剤と 2 500 mL DI 水溶液の 1 L を用意してください。 [テストマネージャ] パネルで [stop] コマンドを送信して、実験を停止します。データは引き続きクラウド対応データベースに保存され、後でダッシュボードのリアルタイムデータパネルで表示することも、オフライン分析用にダウンロードすることもできます。 スマートスリーブからバイアルを取り外し、その後のステップでオーバーフローを避けるために、オートクレーブラックに配置します。 メディアの入力ラインを外し、10% の漂白剤のビーカーに入れます。EVOLVER ユーザーインターフェイスからのポンプをセットアップと同様に実行して、ラインやバイアルを滅菌します。 水でバイアルと水没ラインからラインを切断します。ポンプを実行して、最初にシステムから漂白剤を取り出し、次に空気で洗い流す。 EVOLVER をオフにするには、まず12v 電源をオフにし、5秒待ってから 5 V 電源をオフにします。 10% の漂白剤で攪拌棒とキャップを浸し、その後、DI 水で洗い流します。各キャップの流入と流出のストローは、DI 水を通して洗い流すようにしてください。フィルムが壁に形成されている場合は、試験管ブラシを使用してバイアルをスクラブします。 廃棄物を適正に処分し、廃棄物を十分に洗浄する。注意:廃棄物の容器は、10% の漂白剤、滅菌された細胞培養廃棄物、および微量のエタノールの混合物を含みます。適切な取り扱いと廃棄については、安全コーディネータにご相談ください。 7. 分数母集団のフローサイトメトリー解析を用いた適性の定量化 適切な蛍光チャネルと検出器16を備えたフローサイトメーターを使用して、セクション5から収集されたサンプルを分析します。 サンプルごとに少なくとも1万のイベントを取得し、前方および側面の散布データを使用して、無傷のセルのゲートを確保します。 ゲートは、適切な蛍光チャネル (例えば GFP) に基づいて、各母集団の小数分布を決定する。 コンピュータ上で、[エクスポート] ボタンをクリックして、[テストマネージャ] ページから目的の場所にデータを保存します。 EVOLVER データ・ファイルから、各バイアルの各 timepoint によって完了した世代の数を決定します。EVOLVER コードでは、世代は、最初に各希釈事象間の OD データをセグメント化することによって計算され、次に各セグメントは、各セグメントに対する形態の基本的な指数に適合し、得 r、成長率16である。期間の世代数は、次の式を使用して計算されます。 サンプルが採取された時点での上記の計算からのフローサイトメトリーのデータ対世代番号から、ラベル付きおよびラベルなしの母集団の対数比をプロットします。線形領域を特定し、次の式に従って傾きを合わせます。この傾きは、一般的に競合フィットネス18,19として定義されています。