Реализация нелинейного микроскопа на основе стимулируемого рассеяния Рамана
Summary
В этой рукописи описана реализация стимулируемого Раманского рассеяния (SRS) микроскопа, полученного путем интеграции экспериментальной установки SRS с лазерным сканющим микроскопом. Микроскоп SRS основан на двух фемтосекундных (fs) лазерных источниках, Ти-Сапфире (Ti:Sa) и синхронизированном оптическом параметрическом осцилляторе (OPO).
Abstract
Стимулируемая Рамана россыпь (SRS) микроскопия использует ближний инфракрасный свет возбуждения; поэтому он разделяет многие свойства мультифотоно-микроскопических изображений. Модальность изображения SRS может быть получена с помощью коммерческих лазерных сканируя микроскопов, оснащая неотнесканированный передний детектор с правильными фильтрами bandpass и схемой обнаружения усилителя блокировки (LIA). Схематическая компоновка типичного микроскопа SRS включает в себя следующее: два импульсных лазерных луча (т.е. насос и зонд, направленные в сканирующий микроскоп), которые должны быть перекрыты как в пространстве, так и во времени на плоскости изображения, а затем сосредоточены на микроскоп цели в образец через два сканирующего зеркала (SMs), которые raster фокусное пятно через x-y плоскости. После взаимодействия с образцом передаваемые выходные импульсы собираются верхней целью и измеряются системой переднего обнаружения, вставленной в перевернутый микроскоп. Импульсы насоса удаляются стеком оптических фильтров, в то время как импульсы зонда, которые являются результатом процесса SRS, происходящего в фокусном томе образца, измеряются фотодиодом (PD). Считывание PD сглажается ЛИА для извлечения глубины модуляции. Двухмерное (2D) изображение получено путем синхронизации переднего блока обнаружения с сканирующим блоком микроскопа. В этой работе описана и успешно продемонстрирована реализация микроскопа SRS, а также отчет о безэтикетках изображениях полистироловых бусинок диаметром 3 мкм. Стоит отметить, что микроскопы SRS не доступны на коммерческой уровне, поэтому для того, чтобы воспользоваться этими характеристиками, самодельная конструкция является единственным вариантом. Поскольку микроскопия SRS становится популярной во многих областях, считается, что это тщательное описание реализации микроскопа SRS может быть очень полезным для научного сообщества.
Introduction
В приложениях науки о жизни микроскопия SRS стала мощным инструментом для визуализации без этикеток. Основная идея микроскопии SRS заключается в том, чтобы объединить силу колебательных контрастов и его способность приобретать изображения в течение нескольких секунд.
SRS это процесс, в котором разница в частотах между двумя частотами лазерных лучей (сигнал насоса и топит сигнал на разных частотах) соответствует молекулярной вибрации исследуемого образца, вызывая стимулируемое рассеяние Раман и значительное увеличение сигнала Стокса. В отличие от линейной Рамане-спектроскопии, СРС обладает нелинейной зависимостью от входящих световых полей и производит когерентное излучение. SRS имеет два основных преимущества: 1) скорость, которая делает изображения менее чувствительными к артефактам, возникающим в результате движения образца или деградации, и 2) отличное соотношение сигнала к шуму (SNR). Кроме того, SRS экспонатов спектра идентичны спонтанным Раман, и сигнал SRS линейно пропорционально концентрации химической связи возбужденных1,2,3,4, 5.
В нашем микроскопе, фемтосекунда (fs) SRS экспериментальная настройка интегрирована с перевернутым оптическим микроскопом оснащен быстрым зеркалом сканирующей единицы(Рисунок 1)6,7,8. Для реализации этого микроскопа используются два импульсных лазерных источника. Первый fs-Ti:Sa с продолжительностью пульса около 140 fs, частотой повторения 80 МГц и длиной волн выбросов в диапазоне 680-1080 нм. Второй, используемый в качестве пучка зонда и накачиваемый Ti:Sa, представляет собой фемтосекундный синхронизированный оптический параметрический осциллятор (SOPO), с пульсом продолжительностью около 200 л.с., частотой повторения 80 МГц и длиной волн выбросов в диапазоне 1000-1600 нм. Следует отметить, что минимальная разница в энергии фотона между пучком Ti:Sa и SOPO составляет 2500 см-1. Поэтому, используя эту комбинацию лазерных систем, можно исследовать только высокочастотную область C-H (2800-3200 см-1) Раманских спектров6,7,8.
Для создания микроскопа СРС необходимо рассмотреть три важнейших вопроса, которые описаны в последовательных пунктах. Во-первых, это внедрение высокочастотного метода передачи модуляции (см. рисунок 2 и шаг 2.1 протокола для описания). В экспериментальном исследовании SRS важнейшим параметром является чувствительность системы. Сигнал SRS обнаруживается как небольшое изменение интенсивности лучей возбуждения; таким образом, он может быть поврежден лазерным шумом интенсивности и выстрелом. Эту проблему можно решить путем интеграции этой системы с высокочастотным методом передачи модуляции (см. рисунок 2 и шаг 2.1 протокола для деталей). В этом методе используется электрооптический модулятор (EOM) для модулировать насос. Модуляция, передаваемый на пучок зонда, может быть обнаружена PD после блокирования пучка насоса стеком оптических фильтров (стимулировал обретение Рамана (SRG) режим обнаружения». Выход PD соединен фильтром низкого прохода с усилителем блокировки (LIA), который демонополирует измеренный сигнал. Увеличивая частоту модуляции луча на частоты выше 1 МГц, можно получить внутренний предел ПД.
Вторым вопросом, который необходимо рассмотреть, является установка механической крепления, которая позволяет осуществлять дальновидное обнаружение и в то же время сохранять микроскопическую наблюдение в ярком поле. Кроме того, он должен уменьшить шум из-за механической вибрации во время генерации изображений и обеспечить точное перепозиционирование системы обнаружения (см. рисунок 3 и шаг 2.2 протокола).
Третьим является синхронизация сигнала, полученного по схеме фазочувствительного обнаружения, при этом луч расположен на образце, контролируемом сканирующей головкой микроскопа. Для реализации изображений SMs требуются три сигнала TTL, которые доступны контроллером микроскопа, подключенным к головному блоку сканирования: пиксельные часы, синхронизация линии и синхронизация кадра. Синхронизация достигается путем управления с помощью карты PCI, трех сигналов TTL и приобретения сигналанапряжения на выходном канале LIA 6,7,8. Домашнее программное обеспечение былоразработано и описано ранее 6,7,8, в то время как оборудование системы синхронизации сообщается в рисунке 4.
Фундаментальной процедурой при проведении sRS-изображения является выравнивание микроскопа. Она реализуется в течение четырех этапов, которые описаны в последовательных пунктах. Во-первых, это пространственное перекрытие двух лучей (см. шаг 3.1 протокола). В этой экспериментальной настройки, два луча были пространственно collinearly сочетании дихроического зеркала. Предварительный шаг является выравнивание OPO и Ti:Sa так, что каждый достигает микроскопа. Затем, рассматривая OPO в качестве эталонного луча и пользуясь детектором чувствительного к позиции, Ti:Sa пространственно перекрывается с OPO.
Вторым важным аспектом является временное перекрытие двух лучей (см. шаг 3.2 протокола). Даже если пучки насоса и OPO идеально синхронизированы9, так как они следуют несколько иными путями пучка внутри корпуса OPO, при выходе OPO они имеют задержку во времени около 5 нс и пространственную разницу в 5 см. Поэтому Ti:Sa и OPO требуют повторного времени оптически для обеспечения временного перекрытия в выборке. Это обычно достигается с тонко настраиваемым оптической линией задержки, которая в этом случае вставляется между Ti:Sa и микроскопом (см. рисунок 1). Для получения временного перекрытия двух лучей используются два метода. Первый осуществляется с использованием быстрого PD и осциллоскопа, в то время как второй основан на авто- и кросс-оптических корреляциях. Используя первый метод, получается грубое перекрытие двух лучей (неопределенность 10 сц), в то время как точное временное перекрытие двух лучей получается с помощью кросс-коррелятора (разрешение 1 fs).
Третьим важным аспектом является выравнивание двух лучей внутри микроскопа (см. шаг 3.3 протокола). Предварительное наблюдение белого света образца позволяет индивидуовать желаемое поле зрения (FOV). После этого лазерные лучи, попадая в микроскоп по боковому порту микроскопа, выравниваются для того, чтобы достичь PD, установленного на верхней части(рисунок 3). Однако для правильного приобретения изображения требуется установка ряда параметров (например, размер пикселя и время обитать пикселей). Частота выборки должна соблюдать ограничения, наложенные теорему Нюквиста для сохранения всей информации в изображении, в то время как для правильного соответствия между пространственными координатами пикселей и значением SRS измеряется в каждом пикселе, время интеграции LIA должен быть равным или сопоставимым с пиксельным временем пребывания.
На заключительном этапе выравнивания микроскопа проводятся многочисленные тесты для оптимизации пространственного и временного выравнивания (см. шаг 3.4 протокола). Для оптимизации пространственного перекрытия приобретен ряд изображений передачи (TI) для Ti:Sa и OPO. В TI используется один луч, а интенсивность передаваемого луча из образца измеряется PD. В случае TI реализованo OPO, сигнал выхода PD непосредственно подключен к карте PCI, в то время как в случае TI реализованы Ti:Sa, pd выходной сигнал подключен к LIA и аналоговый выход LIA подключен к карте PCI. Передача изображения очень полезны для оптимизации FOV, освещение, фокусное положение целей микроскопа и проверить, если двалуча пространственно перекрываются 6,7,8.
Оптимизация височного перекрытия насоса и пера пучка зонда осуществляется путем сканирования линии задержки с помощью ступеней 0,001 мм, соответствующих сдвигу в 3,3 fs, и проведения измерения SRS в одной точке образца полистирола 3 мкм в диаметре. Амплитуда сигнала SRS измеряет значения от LIA, как функция задержки зонд-насоса, и обеспечивает максимальное соответствие с точным временным перекрытием двух лучей6,7,8. Прежде чем завершить, следует отметить, что все обсуждаемые шаги являются обязательными для получения высококачественного изображения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроскопия SRS вывела изображения без этикетки на новые высоты, особенно в исследованиясложных биологических структурах, таких как липиды, которые имеют основополагающее значение для клеток и клеточной архитектуры. Липиды участвуют в нескольких физиологических путей, таких как произ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны В. Туфано из IMM CNR за его ценную техническую помощь и Джакомо Коцци, специалистпоув по продуктам от Nikon Instruments, за полезные обсуждения и постоянную поддержку. Эта работа была частично поддержана итальянскими национальными оперативными программами PONa3 00025 (BIOforIU) и крупномасштабным проектом общеевропейской исследовательской инфраструктуры Euro-Bioimaging.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
Referencias
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
