基于刺激拉曼散射的非线性显微镜的实现
Summary
在这份手稿中,描述了通过SRS实验设置与激光扫描显微镜集成而获得的刺激拉曼散射(SRS)显微镜的实现。SRS 显微镜基于两个飞秒 (fs) 激光源,一个 Ti-Sa (Ti:Sa) 和同步光学参数振荡器 (OPO)。
Abstract
刺激拉曼散射(SRS)显微镜使用近红外激发光;因此,它具有许多多光子显微成像特性。SRS 成像模式可以通过配备带适当的带通滤波器和锁定放大器 (LIA) 检测方案的非扫描正向检测器,使用商业激光扫描显微镜获得。典型的 SRS 显微镜的示意图布局包括:两个脉冲激光束(即扫描显微镜中的泵和探头),必须在图像平面的空间和时间上重叠,然后通过显微镜目标聚焦到通过两个扫描镜(SMs)对样品进行光栅,从而在x-y平面上栅格焦点。与样品相互作用后,通过上部目标收集传输的输出脉冲,并通过插入倒置显微镜的正向检测系统进行测量。泵脉冲由一堆光学滤波器去除,而样品焦量中发生的 SRS 过程产生的探头脉冲则由光电二极管 (PD) 测量。PD 的读出由 LIA 解调为调制深度。通过将正向检测单元与显微镜扫描单元同步,获得二维(2D)图像。本文介绍了SRS显微镜的实现并成功地演示了SRS显微镜的实现,并报告了直径为3μm的聚苯乙烯珠子的无标签图像。值得注意的是,SRS显微镜没有商业上,所以为了利用这些特点,自制结构是唯一的选择。由于SRS显微镜在许多领域越来越受欢迎,相信SRS显微镜实现的这种仔细的描述对科学界非常有用。
Introduction
在生命科学应用中,SRS 显微镜已成为无标签成像的强大工具。SRS 显微镜的基本理念是结合振动对比度的强度和在几秒钟内获取图像的能力。
SRS 是两个激光束频率(泵信号和不同频率的斯托克斯信号)与被调查样品的分子振动相匹配的过程,导致刺激拉曼散射和显著的斯托克斯信号的增加。与线性拉曼光谱不同,SRS 表现出对进入光场的非线性依赖,并产生相干辐射。SRS 具有两个基本优势:1) 速度,使图像对样品移动或退化产生的伪影的敏感度降低;2) 出色的信噪比 (SNR)。此外,SRS的光谱与自发拉曼相同,SRS 信号与激发 1、2、3、4 的化学键浓度成线性成正比。 5.
在我们的显微镜中,一个飞秒(fs)SRS实验装置与一个倒置光学显微镜集成,配有快速镜扫描单元(图1)6,7,8。使用两个脉冲激光源来实现此显微镜。第一种是fs-Ti:Sa,脉冲持续时间约为140 fs,重复率为80 MHz,发射波长范围为680-1080 nm。第二种,用作探针束,由Ti:Sa泵送,是一个飞秒同步光学参数振荡器(SOPO),脉冲持续时间约为200fs,重复率为80 MHz,发射波长范围为1000-1600nm。需要注意的是,Ti:Sa 和 SOPO 光束之间的最小光子能量差为 2500cm-1。因此,使用这种激光系统的组合,只有拉曼光谱的高频C-H区域(2800-3200厘米-1)可以探索6,7,8。
为了设置 SRS 显微镜,需要考虑三个关键问题,这些问题在后续段落中介绍。第一种是高频调制传输方法的实现(有关描述,请参阅协议图 2和步骤 2.1)。在SRS实验研究中,一个关键参数是系统的灵敏度。SRS 信号被检测为激励光束强度的微小变化;因此,它可以通过激光强度噪声和拍摄噪声损坏。通过将该系统与高频调制传输方法集成,可以解决此问题(有关详细信息,请参阅协议图 2和步骤 2.1)。在此方法中,使用光电调制器 (EOM) 来调制泵。在用一堆光学滤波器阻挡泵束后,PD 可以检测到传输到探头光束的调制[刺激拉曼增益(SRG)检测模式]。PD 输出通过低通滤波器连接到锁定放大器 (LIA),该放大器可解调测量信号。通过将光束的调制频率提高到1MHz以上,可以得到PD的内在限制。
要考虑的第二个问题是安装一个机械安装,允许进行前向检测,同时在明场保持显微镜观察。此外,它还必须降低图像生成过程中机械振动引起的噪声,并允许检测系统的精确重新定位(参见协议图 3和步骤 2.2)。
第三是相位敏感检测方案获取的信号的同步,光束被放置在显微镜扫描头监测的样品上。为了实现图像,SM 需要三个 TTL 信号,这些信号由连接到扫描头单元的显微镜控制器提供:像素时钟、线路同步和帧同步。同步是通过使用PCI卡、三个TTL信号以及LIA6、7、8的输出通道的电压信号采集来实现的。一个自制的软件已经开发和描述之前6,7,8,而同步系统的硬件报告在图4。
进行 SRS 成像的一个基本步骤是显微镜对准。它通过四个步骤实现,在后续段落中进行了描述。第一个是两个光束的空间重叠(参见协议的步骤3.1)。在这个实验设置中,两束在空间上由二色镜组合而成。初步步骤是 OPO 和 Ti:Sa 的对齐,以便每个步骤都到达显微镜。然后,将 OPO 视为参考光束,并利用位置敏感检测器,Ti:Sa 在空间上与 OPO 重叠。
第二个关键方面是两个光束的时间重叠(参见协议的步骤3.2)。即使泵和OPO光束完全同步9,因为它们遵循OPO外壳内的光束路径略有不同,在OPO出口时,它们的时间延迟约为5 ns,空间差为5厘米。因此,Ti:Sa 和 OPO 需要以光学方式重新定时,以确保样品的时间重叠。这通常通过精细可调的光延时线完成,在这种情况下,该线位于 Ti:Sa 和显微镜之间(参见图 1)。为了获得两束的时态重叠,使用了两种技术。第一种是使用快速PD和示波器进行的,第二个是基于自动和交叉光学相关性。使用第一种技术,获得两个光束的粗略重叠(不确定度为10 ps),而使用交叉相关器(分辨率为1 fs)获得两个光束的精确时间重叠。
第三个关键方面是显微镜内两个光束的对齐(参见协议步骤3.3)。对样品进行初步的白光观测,可以个性化所需的视场 (FOV)。之后,激光束通过显微镜的侧端口进入显微镜,对齐,以到达安装在上部的PD(图3)。但是,要获得正确的图像,需要设置多个参数(例如,像素尺寸和像素放置时间)。采样频率必须尊重奈奎斯特定理施加的约束,以便保留图像中的所有信息,而要在像素的空间坐标和在每个像素中测量的 SRS 值之间保持正确的对应关系,则积分时间的 LIA 应等于或与像素的均衡时间相当。
在显微镜对准的最后一步中,进行了大量测试以优化空间和时间对齐(参见协议步骤 3.4)。为了获得 Ti:Sa 和 OPO 的多个传输图像 (TI),以优化空间重叠。在 TI 中,使用单个光束,并通过 PD 测量来自样品的透射光束强度。在 OPO 实现的 TI 的情况下,PD 输出信号直接连接到 PCI 卡,而在 Ti:Sa 实现的 TI 中,PD 输出信号连接到 LIA,LIA 的模拟输出连接到 PCI 卡。传输图像对于优化FOV、照明、显微镜目标的焦距以及检查两束在空间上是否重叠6、7、8非常有用。
通过扫描与 3.3 fs 时移对应的 0.001 mm 的延迟线,并在直径为 3 μm 的聚苯乙烯珠样品的单点进行 SRS 测量,可以优化泵和探针梁的时间重叠。SRS信号的振幅测量LIA的值,作为探针泵延迟的函数,并提供与两束6、7、8的精确时间重叠对应的最大值。在结束发言之前,应当指出,所有讨论的步骤都是为了获得高质量图像而必须的。
Protocol
Representative Results
Discussion
SRS显微镜将无标签成像带到了新的高度,特别是在复杂的生物结构(如脂质)的研究中,而脂质是细胞和细胞结构的基础。脂质参与多种生理途径,如生物膜的产生,它们作为生物合成前体和信号传感器10。脂质被包装成专门的细胞内细胞器,也称为脂液滴(LDs)。它们的直径从几十纳米到几十微米11,12不等。LD 不仅大量参与脂肪和类固醇生成细胞,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢IMM CNR的V.Tufano提供的宝贵技术支持,并感谢尼康仪器产品专家贾科莫·科齐(Giacomo Cozzi)提供有益的讨论和持续的支持。这项工作得到了意大利国家运营方案PONa3 00025(BIOforIU)和欧洲生物成像大型泛欧研究基础设施项目的部分支持。
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
Referencias
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
