Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization
Summary
Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.
Abstract
Atomik kuvvet mikroskopisi bazlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi (AFM-SCFS), yaşam hücrelerinin Biyofizik özelliklerini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, hücreler, reseptör ve ligler arasında ve diğer birçok varyasyonların yanı sıra, canlı bir hücre membranında etkileşim kuvvetlerini ve dinamiklerini araştırarak sağlar. Ayrıca, belirli hücre aktivasyonu ve sonraki hücresel olayların canlı hücre ile kombine edildiğinde gerçek zamanlı olarak izlenmesi için izin, böylece bir spatiotemporally kontrollü bir şekilde tek hücrelerde fiziksel veya biyokimyasal uyarıcı teslim etmek için bir mekanizma olarak çalışır floresans görüntüleme. Bu AFM-SCFS ölçümlerinde anahtar adım AFM-Cantilever functionalization, ya da başka bir deyişle, konsol için ilgi bir konu iliştirmek. Burada, immünolojik çalışmalar için sırasıyla tek bir T hücresi ve tek bir polistiren boncuk ile AFM atölyeler değiştirmek için yöntemler sunuyoruz. Eski bir çözelti içinde düz bir konsol ucunu çiftler tek T hücreleri bir biyouyumlu tutkal içerir, ikincisi hava ortamında tek boncuk yapışma için bir epoksi tutkal dayanır iken. Her bir konsol modifikasyonu ile ilişkili iki immünolojik uygulama da sağlanır. Burada açıklanan yöntemler, farklı hücre türlerine ve katı parçacıklara kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Atomic Force microkopi (AFM), çok yönlü bir araç, hücre Biyoloji araştırma1,2,3,4,5birçok uygulama buldu. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme özelliğinden farklı olarak, doğal kuvvet yoklama özelliği, yaşam hücrelerinin Biyofizik özelliklerinin, tek hücreli6,7‘ de doğrudan situ ‘da araştırılmasını sağlar. Bunlar, alt hücreli yapıların sertlik ve hatta tüm hücreler8,9,10,11,12, spesifik ligand/reseptör bağlama güçlü içerir tek molekül seviyesi hücre yüzeyi13, ve tek çiftleri arasında katı parçacıklar ve hücreler veya iki hücre arasında yapışma güçleri1,2,14,15. İkinci iki genellikle tek hücreli kuvvet spektroskopisi (SCFS)16olarak sınıflandırılır. Çeşitli bahar sabiti ile kolayca kullanılabilir atölyeler sayesinde, AFM erişilebilir kuvvet aralığı oldukça birkaç piconewtons (PN) mikronewtons (μn), hangi yeterli hücresel olayların tüm aralığı kapsar birkaç onlarca güçler içeren geniş pN, reseptör tabanlı tek molekül bağlama gibi, nN için, gibi phagositik hücresel olaylar15. Bu büyük dinamik kuvvet aralığı, AFM ‘ye, optik/manyetik cımbız ve Biomembran kuvvet sondası gibi diğer kuvvet prob teknikleri üzerinde avantajlı hale getirir, çünkü zayıf kuvvet ölçümleri için daha uygundur, genellikle 200 pN17 ‘ den az kuvvet ile , 18. Buna ek olarak, AFM, tek hücrelere çeşitli uyaranlara teslim etmek için yüksek hassasiyetli manipülatör olarak işlev verebilir bir spatiotemporally tanımlanan şekilde4,19. Bu gerçek zamanlı tek hücreli aktivasyon çalışmaları için arzu edilir. Canlı hücreli floresan görüntüleme ile birlikte, spesifik uyarıcı için sonraki hücresel yanıt aynı anda izlenebilir, böylece AFM tabanlı scfs son derece sağlam optik görüntüleme olarak hücresel sinyal prob için pratik bir araç sağlayan güçlü hale. Örneğin, osteoblastlar20‘ de kalsiyum geçişler için gerekli suşları belirlemek için AFM kullanılmıştır. Bu çalışmamızda, lokalize kuvvetlerin bir AFM ucu ile kültürlü osteoblastlar üzerinde uygulanması sonrasında kalsiyum onay görüntülemesi ile floresan kalsiyum geçitleri izlenen. Son zamanlarda, AFM hangi hepatik stellat hücreler (HSC) büyüdü ve bu mechano-dönüştürücü HSC aktivasyon gerçek zamanlı bir floresan src biosensor tarafından izlenen olan fosforilasyon tarafından temsil edilen kollajen fibriller germe için istihdam edildi biosensörün floresan yoğunluğu HSC aktivasyonu ile ilişkilidir3.
AFM tabanlı scfs deneylerinde, AFM atölyeler uygun functionalization başarılı ölçümler doğru önemli bir adımdır. Araştırmalarımız bağışıklık hücrelerinin aktivasyonuna odaklandığı için, biz rutin olarak fagositoz ve/veya güçlü immün tepkiler tetikleyebilir tek katı parçacıklar gibi partikül konuları ile konsol functionalize4,14 , 15 ve tek T hücreleri bu aktif dendritik hücreler (DC)2gibi antijen sunan hücreler, bir bağışıklık sinaps oluşturabilir. Tek katı parçacıklar normal olarak bir konsol ile hava ortamında bir epoksi tutkal ile birleştiğinde, tek T hücreleri, onların yapışkan olmayan doğası nedeniyle, çözüm bir biyouyumlu tutkal aracılığıyla bir konsol functionalized. Burada, bu iki tür konsol değişikliğini gerçekleştirmek ve aynı zamanda iki ilişkili uygulama vermek için yöntemleri tarif ediyoruz. İlk uygulama, T Cell/DC etkileşimlerini AFM-SCFS ile araştırmanın hücre mekaniği açısından düzenleyici T hücrelerinin bastırıcı mekanizmasını anlamak içindir. İkincisi, reseptör bağımsız fosfatidilositol 4, 5-bisfosfat (PIP2) molekül mekanizmasını ortaya çıkarmak için gerçek zamanlı olarak makro Phage sağlam bir parçacık için hücresel tepkisi izlemek için canlı hücreli floresan görüntüleme ile AFM birleştirerek içerir- Moesin aracılı fagositoz. Bu protokolün amacı, ilgili araştırmacıların immünolojik araştırmalar için AFM tabanlı tek hücreli analizlerle kendi deneysel ayarlarını tasarlayıp uygulamalarına yönelik bir referans çerçevesi sağlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM tabanlı tek hücreli kuvvet spektroskopisi, yaşayan hücrelerin Biyofizik özelliklerini ele almak için güçlü bir araç olarak gelişti. Bu uygulamalar için, konsol ilgi hücrelerinde belirli etkileşimleri veya özellikleri araştırma için düzgün işlevselleştirilmiş olması gerekir. Burada, tek T hücresi ve tek mikron büyüklüğünde boncuk için ucu-Less konsol bağlama yöntemleri sırasıyla açıklanmıştır. Tek bir T hücresi eklemek için, hücre yapıştırıcı olarak biyouyumlu bir tutkal…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin genel programı (31370878), devlet anahtar programı (31630023) ve yenilikçi araştırma grubu programı (81621002) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
Referencias
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
