Arabidopsis 'In alt lavabo dokularında yüklü CFDA Tracer Shootward hareketi
Summary
Bu protokol amacı nasıl Arabidopsisalt kısımlarında farklı sitelere CFDA yüklemek için göstermek için. Daha sonra çekim içinde CF ortaya çıkan dağıtım deseni sunuyoruz.
Abstract
Symplastic Tracer 5 (6)-carboxyfluorcein diasetat (CFDA), hücresel bağlantı, floem taşımacılığı ve vasküler desenlerin ortaya koyduğu yaşam tesislerinde yaygın olarak uygulanmaktadır. Bu protokol, sırasıyla kök kesme ve ikiyüzlü pinching prosedürünü kullanarak Arabidopsis ‘te Alta-to-top carboxyflorcein (CF) hareketini gösterir. Bu iki farklı prosedür, CF hareketinin farklı verimlilikleri ile sonuçlanır: yaklaşık% 91 ‘ i, iki yüzlü-pinching prosedürü ile çekimler içinde CF ‘nin% 70 ‘ i, root-kesme prosedürü ile CF ‘nin yaklaşık%% ‘ i. Bu simplastik boya mobil verimlilikte önemli değişiklikler sonuçlanan yükleme siteleri, basit değişiklik, CF hareketi en büyük olasılıkla kök-ikiyüzotil kavşak tarafından, symplastic yönetmeliğine tabi olabilir öneriyor.
Introduction
5 (6)-karboksflorcein (CF)1, 8-hidrokpliroidi-1, 3, 6-trisulphonik asit2, Lucifer sarı ch (lych)3, esculin ve cter4gibi spektral özellikleri bir dizi ile birçok floresan izleyiciler geliştirilmiştir ve symplastik hareketi ve floem aktivitesini izlemek için bitkiler uygulanır. Genellikle, bir symplastic boya hedef doku bir kesim içine yüklenir ve bitkinin diğer bölgelerine içine gazetecinin sıralı dağılım hücresel iletişim gösterecektir. Boya emilimi mekanizması tam olarak anlaşılmamış olsa da, canlı hücreler içinde temel CF hareketinin ilkesi yaygın olarak kabul edilmiştir. CF (CF diacetate, CFDA) ester formu floresan olmayan, ancak membran geçirgen. Bu özellik, boyanın hücrelere hızlı membran difüzyon sağlar. Canlı hücreler içinde bir kez, hücre içi esterleri 3 ‘ ve 6 ‘ CFDA pozisyonunda asetat grupları kaldırmak, floresan ve membran geçirmez CF serbest (Şekil 1, alternatif Wright ve al.2bakın); CF daha sonra plasmodesmata aracılığıyla bitkilerin diğer bölgelerine taşıyabilirsiniz.
CFDA ile iyi kurulan bir prosedür bu kaynak yaprakları içine yüklenebilir ve floem akışı ve birçok türün lavabo dokularında boşaltma floem izlemek için kullanılan olduğunu, örn, Arabidopsis root5CF boşaltma olarak, floem boşaltma patates tüberkülasyonu6sırasında, Nicotiana lavabo içinde floem boşaltma7yaprakları, ve benzeri. Benzer yükleme yaklaşımlarıyla, diğer çalışmalar bu boya ana bilgisayar ve parazit arasında symplastic bağlantı göstermek için benimsenen8,9, ya da simbiyotik ilişkiler ortaya çıkarmak için10,11.
Bu boyayı kullanımın başka bir yolu da, dağıtım düzenini belirlemek için belirli hücrelere veya tek hücreye mikroenjeksiyon yoluyla yüklenecektir. Bu tür sofistike teknikler, özellikle symplastic Domain12,13konseptinin geliştirilmesinde, plasmodesmata-aracılı hücresel iletişimin daha derin anlayışımızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Örneğin, Arabidopsis kotiledon hücrelerine CFDA Mikroenjeksiyonu, ikiyüzlülik epidermis ancak altta yatan hücrelerde veya kök epidermis içinde boya-bağlantı deseni sonuçlandı, bu nedenle iki yüzlü epidermis formları symplastic etki alanı14. Evcikli Guard hücreleri gibi benzer etki alanları15, elek element-Companion hücreleri16, kök saç hücreleri14 ve root Cap17,18 mikroenjeksiyon tekniği ile tespit edilmiştir. En şaşırtıcı şekilde, bazı etki alanları izleyici moleküllerinin belirli bir yönde hareket etmesine izin verir. Örneğin diken alan alın, destekleyici epidermal hücreye bir floresan prob mikroenjeksiyon diken etki içine izleyici akışına yol açar, ancak, ters enjeksiyon gerçek tutmaz19. Son raporda ayrıca Sedum embriyo20‘ nin symplastic alanlarında da benzer durumlar bulunmuştur. Bu nedenle, yukarıdaki tüm durumlarda yükleme sitelerinin takas symplastik iletişim içine yeni Öngörüler yol açabilir anlamına gelir. Önceki deney kök-to-Shoot mobil susturma rota incelemek amaçlayan bir roman symplastic etki alanı veya HEJ (ikiyüzsüz-epicotyl Junction) bölge, daha fazla kök yükleme (non-kurallı lavabo-yükleme) CFDA üzerinden doğrulanmıştır tespit Deneme21. Burada, biz daha basit bir yöntem kullanarak root-to-Shoot CF hareketi ayrıntılı ve yükleme sitelerini değiştirerek potansiyel bir symplastic etki alanı kurtarmak. Ayrıca bu prosedür, kökten ateş eden uzun mesafe taşımacılığını değiştiren genetik kökenleri ayırt etmek için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gelişmekte olan çalışmalar bitkiler hızla dış uyaranlara yanıt verebilir göstermiştir23, manipülasyon da dahil olmak üzere deneysel prosedürler tanıtıldı22. İlk deneyimizde, bu bilginin gözetimi genellikle boyama başarısızlığa yol açar. Bu derslerle, bu deneyi yaparken aşağıdaki önlemlerin akılda tutulması gerektiğini öneriyoruz: (1) hasat sonrası tohumlar düşük sıcaklık ve düşük nemi ayarlamak için bir depolama kabininde tutulmalı…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin ‘in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (31671257) ve Hubei ortak yenilik Merkezi tahıl endüstrisi (LXT-16-18) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade | |
Referencias
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
